In Vivo Immunfluoreszenzlokalisation zur Bewertung der therapeutischen und diagnostischen Antikörperbiodistribution in der Krebsforschung
Summary
Die In-vivo-Immunfluoreszenzlokalisationsmethode (IVIL) kann verwendet werden, um die In-vivo-Bioverteilung von Antikörpern und Antikörperkonjugaten für onkologische Zwecke in lebenden Organismen mit einer Kombination aus In-vivo-Tumor-Targeting und Ex-vivo-Immunfärbung zu untersuchen. Methoden.
Abstract
Monoklonale Antikörper (mAbs) sind wichtige Instrumente zur Krebserkennung, -diagnose und -behandlung. Sie werden verwendet, um die Rolle von Proteinen in der Tumorgenese zu entwirren, können auf Krebsbiomarker gerichtet werden, die die Erkennung und Charakterisierung von Tumoren ermöglichen, und können für die Krebstherapie als mAbs oder Antikörper-Wirkstoff-Konjugate verwendet werden, um Immuneffektorzellen zu aktivieren, Signalwege oder direkt töten Zellen, die das spezifische Antigen tragen. Trotz klinischer Fortschritte bei der Entwicklung und Produktion neuartiger und hochspezifischer mAbs können diagnostische und therapeutische Anwendungen durch die Komplexität und Heterogenität der Tumormikroumgebung beeinträchtigt werden. Für die Entwicklung effizienter Antikörper-basierter Therapien und Diagnostika ist es daher entscheidend, die Bioverteilung und Wechselwirkung des Antikörper-basierten Konjugats mit der lebenden Tumormikroumgebung zu bewerten. Hier beschreiben wir In Vivo Immunofluoreszenzlokalisierung (IVIL) als einen neuen Ansatz zur Untersuchung von Wechselwirkungen von Antikörper-basierten Therapeutika und Diagnostika unter den in vivo physiologischen und pathologischen Bedingungen. Bei dieser Technik wird ein therapeutischer oder diagnostischer Antigen-spezifischer Antikörper invivo in vivo injiziert und ex vivo mit einem sekundären Antikörper in isolierten Tumoren lokalisiert. IVIL spiegelt daher die In-vivo-Bioverteilung von Antikörper- und Targeting-Mitteln wider. Zwei IVIL-Anwendungen werden beschrieben, um die Bioverteilung und Zugänglichkeit von Antikörper-basierten Kontrastmitteln für die molekulare Bildgebung von Brustkrebs zu bewerten. Dieses Protokoll wird es zukünftigen Anwendern ermöglichen, die IVIL-Methode an ihre eigenen Antikörper-basierten Forschungsanwendungen anzupassen.
Introduction
Monoklonale Antikörper (mAb) sind große Glykoproteine (ca. 150 kDa) der Immunglobulin-Überfamilie, die von B-Zellen abgesondert werden und eine primäre Funktion im Immunsystem haben, um die biologische Funktion von bakterielle oder virale Krankheitserreger und kann abnorme Proteinexpression auf Krebszellen erkennen1. Antikörper können eine extrem hohe Affinität zu ihren spezifischen Epitopen bis hin zu Femtomolarenkonzentrationen haben, was sie zu vielversprechenden Werkzeugen in der Biomedizin2macht. Mit der Entwicklung der Hybridom-Technologie durch Milstein und Köhler (Nobelpreis 1984) wurde die Produktion von mAbs möglich3. Später wurden menschliche mAbs mit der Phagenanzeige-Technologie oder transgenen Mausstämmen erzeugt und revolutionierten ihre Verwendung als neuartige Forschungswerkzeuge und Therapeutika4,5.
Krebs ist ein weltweites Gesundheitsproblem und eine der Hauptursachen für den Tod, was die Notwendigkeit neuer Ansätze für Prävention, Erkennung und Therapie schafft6. Bis heute haben mAbs die Extrication der Rolle von Genen und ihren Proteinen bei der Tumorgenese ermöglicht und können, wenn sie gegen Krebsbiomarker gerichtet sind, die Tumorerkennung und Charakterisierung für die Schichtung des Patienten ermöglichen. Für die Krebstherapie werden bispezifische mAbs, Antikörper-Wirkstoff-Konjugate und kleinere Antikörperfragmente als Therapeutika entwickelt, und für die gezielte Wirkstoffabgabe zur Verbesserung der therapeutischen Wirksamkeit7. Zusätzlich dienen Antikörper für die Biomarker-Targeting von Kontrastmitteln für molekulare bildgebende Modalitäten wie Fluoreszenz-geführte Chirurgie, photoakustische (PA) Bildgebung, Ultraschall (US) molekulare Bildgebung und klinisch verwendete Positronenemission Tomographie (PET) oder Einzelphotonen-Emissions-Computertomographie (SPECT)8. Schließlich können Antikörper auch als Theranost-Wirkstoffe eingesetzt werden, die eine Schichtung der Patienten und eine Reaktionsüberwachung für gezielte Therapien ermöglichen9. Daher beginnen neuartige mAbs eine entscheidende Rolle bei der Krebserkennung, -diagnose und -behandlung zu spielen.
Trotz kritischer Fortschritte bei der Entwicklung und Produktion neuartiger und hochspezifischer mAbs können diagnostische und therapeutische Anwendungen aufgrund der Komplexität der Tumorumgebung unwirksam gemacht werden. Antikörperwechselwirkungen sind abhängig von der Art des Epitops, d.h.,ob es linear oder konform10ist. Neben der Erkennung von Antigenen müssen Antikörper natürliche Barrieren wie Gefäßwände, Basalmembranen und tumorstroma überwinden, um Zielzellen zu erreichen, die das Antigen exdrücken. Antikörper interagieren mit dem Gewebe nicht nur durch die variable Fragmentantigenbindung (Fab) Domäne, sondern auch durch das konstante kristalline Fragment (Fc), das weiter zu off-site Interaktionen führt11. Das Targeting wird auch durch die heterogene Expression von Tumormarkern in der Tumormasse und Heterogenität in der Tumorvaskularisation und dem Lymphsystem12,13erschwert. Darüber hinaus besteht die Tumormikroumgebung aus krebsassoziierten Fibroblasten, die Tumorzellen unterstützen, Tumorimmunzellen, die Anti-Tumor-Immunreaktionen unterdrücken, und dem Tumorendothel, das den Transport von Sauerstoff und Nährstoffen unterstützt, die das Eindringen, die Verteilung und die Verfügbarkeit von Antikörper-basierten Therapeutika oder Diagnostika beeinträchtigen. Insgesamt können diese Überlegungen die therapeutische oder diagnostische Wirksamkeit einschränken, das Behandlungsverhalten reduzieren und zu Tumorresistenzführen führen.
Daher ist es für die Entwicklung effizienter Antikörper-basierter Therapien und Diagnostika entscheidend, die Bioverteilung und Wechselwirkung des Antikörper-basierten Konjugats innerhalb der Tumormikroumgebung zu bewerten. Derzeit wird in präklinischen Studien die Markerexpression in Tumorforschungsmodellen ex vivo durch Immunfluoreszenz (IF) Färbung von Tumorabschnitten14analysiert. Standard-IF-Färbung wird mit primären markerspezifischen Antikörpern durchgeführt, die dann durch sekundäre fluoreszierend markierte Antikörper auf ex vivo Tumorgewebescheiben hervorgehoben werden, die vom Tier isoliert wurden. Diese Technik hebt die statische Position des Markers zum Zeitpunkt der Gewebefixierung hervor und gibt keinen Einblick, wie sich die antikörperbasierten Therapeutika oder Diagnostika unter physiologischen Bedingungen verteilen oder interagieren könnten. Die molekulare Bildgebung durch PET, SPECT, US und PA kann Informationen über die antikörperkonjugierte Kontrastmittelverteilung in lebenden präklinischen Modellen8,15liefern. Da es sich bei diesen bildgebenden Modalitäten um nicht-invasive, Längsschnittstudien handelt und zeitkritische Daten mit einer minimalen Anzahl von Tieren pro Gruppe gesammelt werden können. Diese nicht-invasiven molekularen bildgebenden Ansätze sind jedoch nicht empfindlich genug und haben nicht genügend Auflösung für die Lokalisierung der Antikörperverteilung auf zellulärer Ebene. Zusätzlich können die physikalischen und biologischen Eigenschaften des primärantikörpers durch die Konjugation eines Kontrastmittels drastisch verändert werden16.
Um die in vivo physiologischen und pathologischen Bedingungen zu berücksichtigen, wie antikörperbasierte Therapeutika und Diagnostika innerhalb der Tumorumgebung interagieren und eine hochauflösende zelluläre und sogar subzelluläre Verteilung zu erhalten Profile von nicht konjugierten Antikörpern schlagen wir einen IF-Ansatz vor, der als In-Vivo-Immunfluoreszenzlokalisation (IVIL) bezeichnet wird, bei dem der antigenspezifische Antikörper intravenös in vivo injiziert wird. Der Antikörper-basierte therapeutische oder diagnostische, als primärer Antikörper wirkt, zirkuliert in funktionellen Blutgefäßen und bindet an sein Zielprotein in der hochgenauen, lebenden Tumorumgebung. Nach isolierung von in vivo-markierten Tumoren mit dem primären Antikörper wird ein sekundärer Antikörper verwendet, um angesammelte und zurückgehaltene Antikörperkonjugate zu lokalisieren. Dieser Ansatz ähnelt einem zuvor beschriebenen IF-Histologie-Ansatz, bei dem fluoreszierend markierte Antikörper17injiziert werden. Obwohl hier, die Verwendung von nicht konjugierten Antikörpern vermeidet eine mögliche Änderung der Bioverteilungseigenschaften durch Antikörpermodifikation induziert. Darüber hinaus vermeidet die Ex-vivo-Anwendung von fluoreszierendem Sekundärantikörper einen möglichen Verlust des Fluoreszenzsignals während der Gewebeentnahme und -verarbeitung und sorgt für eine Verstärkung der Fluoreszenzsignalintensität. Unser Etikettierungsansatz spiegelt die In-vivo-Biodistribution von Antikörper-basierten Medikamenten und gezielten Wirkstoffen wider und kann wichtige Erkenntnisse für die Entwicklung neuartiger diagnostischer und therapeutischer Wirkstoffe liefern.
Hier beschreiben wir zwei Anwendungen der IVIL-Methode, wie sie in früheren Studien zur Bioverteilung und Zugänglichkeit von Antikörper-basierten Kontrastmitteln für molekulare bildgebende Ansätze zur Brustkrebserkennung angewandt wurden. Erstens die Bioverteilung eines Antikörper-nahen Infrarotfarbstoffkonjugats (Anti-B7-H3-Antikörper, der an den nahen Infrarotfluoreszenzfarbstoff, Indocyaningrün, B7-H3-ICG) und des Isotypkontrollmittels (Iso-ICG) für Fluoreszenz und photoakustische molekulare molekulare Bildgebung wird untersucht18. Die Methode dieser Anwendung wird im Protokoll beschrieben. Als nächstes werden die Bioverteilungsergebnisse eines konformen Antikörpers gegen Netrin-1, der in der Regel nicht mit herkömmlicher IF-Bildgebung nachweisbar ist und mit ultraschallmolekularer Bildgebung verwendet wird, quantifiziert und in den repräsentativen Ergebnissen19dargestellt. Am Ende dieses Protokollpapiers sollten sich leserende Menschen wohl fühlen, wenn sie die IVIL-Methode für ihre eigenen Antikörper-basierten Forschungsanwendungen anwenden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Methode hat mehrere kritische Schritte und erfordert potenzielle Änderungen, um eine erfolgreiche Implementierung sicherzustellen. Erstens müssen die Dosierung und das Timing der intravenösen Injektion von Antikörper/Antikörperkonjugat auf die jeweilige Anwendung zugeschnitten sein. Im Allgemeinen sollten Dosierungen verwendet werden, die mit der Art und Weise übereinstimmen, wie das Antikörperkonjugat typischerweise verwendet wird, d. h. passende Dosierungen des therapeutischen Antikörpers oder des Antikö…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Andrew Olson (Stanford Neuroscience Microscopy Service) für Diskussionen und den Einsatz von Geräten. Wir danken Dr. Jürgen K. Willmann für seine Betreuung. Diese Studie wurde durch das NIH R21EB022214 Grant (KEW), NIH R25CA1118681 Training Grant (KEW) und NIH K99EB023279 (KEW) unterstützt. Der Stanford Neuroscience Microscopy Service wurde von NIH NS069375 unterstützt.
Materials
| Animal Model | |||
| FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J | The Jackson Laboratory | 002374 | Females, 4-6 weeks of age |
| Animal Handling Supplies | |||
| 27G Catheter | VisualSonics | Please call to order | Vevo MicroMarker Tail Vein Access Cannulation Kit |
| Alcohol Wipes | Fisher Scientific | 22-246073 | |
| Gauze Sponges (4" x 4" 16 Ply) | Cardinal Health | 2913 | |
| Heat Lamp | Morganville Scientific | HL0100 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29404 | |
| Ophthalmic Ointment | Fisher Scientific | NC0490117 | |
| Surgical Tape | 3M | 1530-1 | |
| Tissue Collection | |||
| Disposable Base Molds | Fisher Scientific | 22-363-556 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Medium | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Surgical London Forceps | Fine Science Tools | 11080-02 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Antibodies | |||
| AlexaFluor-488 goat anti-rat IgG | Life Technologies | A-11006 | |
| AlexaFluor-546 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A-11010 | |
| AlexaFluor-594 goat anti-human IgG | Life Technologies | A11014 | |
| Human IgG Isotype Control | Novus Biologicals | NBP1-97043 | |
| Humanized anti-netrin-1 antibody | Netris Pharma | contact@netrispharma.com | |
| Rabbit anti-Mouse CD276 (B7-H3) | Abcam | ab134161 | EPNCIR122 Clone |
| Rat anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 550274 | MEC 13.3 Clone |
| Reagents | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
| Clear Nail Polish | Any local drug store | ||
| Indocyanine Green – NHS | Intrace Medical | ICG-NHS ester | |
| Mounting Medium | ThermoFisher Scientific | TA-006-FM | |
| Normal Goat Serum | Fisher Scientific | ICN19135680 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14190250 | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Supplies | |||
| Adhesion Glass Slides | VWR | 48311-703 | |
| Desalting Columns | Fisher Scientific | 45-000-148 | |
| Glass Cover Slips | Fisher Scientific | 12-544G | |
| Hydrophobic Barrier Pen | Ted Pella | 22311 | |
| Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| Slide Staining Tray | VWR | 87000-136 | |
| Software | |||
| FIJI | LOCI, UW-Madison. | Version 4.0 | https://fiji.sc/ |
Riferimenti
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