인간 코드 혈액 유래 CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포의 범골수성 분화
Summary
여기서, 우리는 4개의 골수성 혈통에 제대혈 유래 CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포의 면역표현특성 및 사이토카인 유도분화를 위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜의 적용은 CD34+ 세포의 골수성 분화에 대한 골수성 질환 돌연변이 또는 소분자의 영향에 대한 조사를 포함한다.
Abstract
인간 조혈줄기세포의 생체내 분화는 조혈을 연구하기 위한 널리 사용되는 모델이다. 여기서 기재된 프로토콜은 4개의 골수성 혈통 세포로 의 CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포의 분화를 유도하는 사이토카인을 위한 것이다. CD34+ 세포는 인간 탯줄 혈액으로부터 단리되고 사이토카인이 존재할 때 MS-5 기질 세포와 병용배한다. 줄기 및 전구 세포의 면역표현특성, 및 분화된 골수성 혈통 세포가 기재되어 있다. 이 프로토콜을 사용하여, CD34+ 세포는 작은 분자로 배양되거나 골수성 분화에 미치는 영향을 조사하기 위해 골수성 질환 돌연변이를 발현하기 위해 렌티바이러스로 트랜스화될 수 있다.
Introduction
조혈 줄기 세포 (HSCs)의 정상적인 분화는 모든 혈액 세포 계의 생리적 수준의 유지에 중요합니다. 분화 도중, 성장 인자 및 사이토카인을 포함하여 세포외 단서에 조정된 반응에서, HSCs는 먼저 림프-골수성 전위가 있는다능한 전구 (MPP) 세포를 초래합니다 1,2,3 ,4 (그림 1). MPP는 일반적인 골수성 전구 (CMP) 및 일반적인 림프종 전구 (Clps)를 계보 제한되는 초래합니다. CLPs는 B, T 및 자연 킬러 세포로 구성된 림프계로 분화합니다. CmP는 2개의 더 제한된 전구 인구, 거핵구 적혈구 전구체 (MEPs) 및 과립 구체 질 전구체 (GPS)를 통해 골수성 계보를 생성합니다. MEP는 거핵구와 적혈구를 초래하는 반면, GPS는 과립구및 단핵구를 초래합니다. CmPs를 통해 발생하는 것 외에도, 거핵구는 또한 비 표준 경로5,6을통해 HSC 또는 초기 MPP에서 직접 발생하는 것으로 보고되었다.
조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)는 표면 마커 CD34 및 계보 특이적 마커의 결여(Lin-)를 특징으로 한다. HSC 및 골수성 전구 집단을 구별하기 위해 일반적으로 사용되는 다른 표면 마커는 CD38, CD45RA 및 CD123 2(도1)를포함한다. HSC와 MpP는 각각 린–/CD34+/ CD38– 및 린–/ CD34+/ CD38+입니다. 골수성 전구 인구는 CD45RA 및 CD123의 존재 또는 부재에 의해 구별됩니다. CMP는 린–/CD34+/CD45RA–/ CD123lo,GMP는 린–/CD34+/ CD38+/ CD45RA+/CD123로,그리고 MEP는 린–/CD34+ /CD38+/CD45RA–/CD123–.
CD34+ 줄기 및 전구 세포의 총 집단은 인간 탯줄 혈액(UCB), 골수 및 말초 혈액으로부터 얻을 수 있다. CD34+ 세포는 인간 UCB에서 총 단핵 세포 (MNCs)의 0.02 % ~ 1.46 %를 구성하는 반면, 그 비율은 골수에서 0.5 %와 5.3 % 사이에서 변화하며 말초 혈액7,8,9에서 0.01 %로 훨씬 낮습니다. . UCB 유래 CD34+ 세포의 증식 능력 및 분화 전위는 골수 또는 말초 혈액 세포1,10보다현저히 높으며, 이를 통해 구득을 위한 뚜렷한 이점을 제공한다. 분화 하는 동안 세포의 면역 표현 형 및 형태 학적 특성 분석을 수행과 함께 분자 분석을위한 충분한 물질.
제대혈 유래 CD34+ HSPC의 생체내 분화는 정상적인 조혈 및 조혈 질환 기전을 조사하기 위한 널리 적용되는 모델이다. 적절한 사이토카인으로 배양할 때, UCB CD34+ HSPC는 골수성 또는 림프성 혈통11,12,13,14,15를 따라 분화하도록 유도될 수 있다. , 16. 여기서, 우리는 인간 UCB로부터CD34+ HSPC의 격리 및 면역 표현형 특성화및 골수성 혈통 세포에 대한 이들의 분화를 위한 프로토콜을 기술한다. 이러한 배양 시스템은 골수에서 미세환경을 모방하기 위해 MS-5 기질 세포의 존재에 있는 HSPC의 사이토카인 유도 분화에 기초한다. 배양 조건은 CD34+ 세포의 초기 팽창을 일으키고, 이어서 4개의 골수성 계보 세포, 즉 과립구(CD66b), 단핵구(CD14), 거핵구(CD41) 및 적혈구 (CD235a). CD34+ 세포 분화 프로토콜의 응용은 조혈을 조절하는 분자 메커니즘에 대한 연구, 및 골수성 질환 관련 돌연변이 및 소분자가 자가 재생에 미치는 영향에 대한 연구를 포함하고 있으며, HSPC의 차별화.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서 기재된 프로토콜은 UCB 유래 CD34+ HSPC의 생체 내 분화에 적합하여 4개의 골수성 혈통으로 한다. SCF, TPO, Flt3L 및 IL3로 구성된 사이토카인 혼합물을 사용하여 초기 배양은 CD34+ 세포를 자극한다. 그 후, SCF, IL3, Flt3L, EPO 및 TPO의 칵테일로 차별화가 달성됩니다. 이 혼합에서, SCF, IL3 및 Flt3L은 CD34+ HSC의 생존과 확산에 중요합니다. EPO와 TPO는 각각 적혈구 및 거핵구로 의 분화?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 비식별 및 기증 코드 혈액 단위에 대한 마리코파 통합 건강 시스템의 웬디 배럿, 레이첼 카바예로, 가브리엘라 루이스, 흐름 세포 측정에 대한 도움을 Mrinalini 칼라, 게이 도둑과 크리스토퍼 씨트에 감사드립니다 전 생체 골수성 분화에 대한 조언. 이 작품은 건강의 국가 학회 (R21CA170786 및 R01GM127464)와 미국 암 학회 (기관 연구 보조금 74-001-34-IRG)에서 S.S.에 기금에 의해 지원되었습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
Materials
| 0.4% Trypan blue solution | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | Dilute working stock to 0.2% in sterile 1x PBS |
| 0.5 M UltraPure Ethylene diamine tetra acetic acid, pH 8.0 | Gibco | 15575-038 | |
| 10x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14185052 | Dilute to 1x with sterile distilled water & pH to 7.2 |
| 2.5% Trypsin, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15090046 | Dilute working stock to 1x with sterile 1x PBS |
| 30 µm Pre-separation filters | Miltenyi biotech | 130-041-407 | |
| 35% sterile Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7979 | |
| 7-AAD | Biolegend | 420404 | Used as a live/dead stain to eliminate dead cells from FACS analysis |
| Anti-human CD10-FITC antibody (Clone HI10a) | Biolegend | 312207 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD11b-FITC (activated) antibody (Clone CBRM1/5) | Biolegend | 301403 | Use 1:5 dilution |
| Anti-human CD123-APC antibody (Clone 6H6) | Biolegend | 306012 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD14-PE antibody (Clone M5E2) | Biolegend | 301806 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD19-FITC antibody (Clone 4G7) | BD Biosciences | 347543 | Use 1:5 dilution |
| Anti-human CD235a-APC antibody (Clone GA-R2 (HIR2)) | BD Biosciences | 551336 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD235a-FITC antibody (Clone HIR2) | Biolegend | 306609 | Use 1:50 dilution |
| Anti-human CD34-APC-Cy7 antibody (Clone 581) | Biolegend | 343514 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD38-PE antibody (Clone HIT2) | Biolegend | 303506 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD3-FITC antibody (Clone UCHT1) | Biolegend | 300405 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD41a-PerCP-Cy5.5 antibody (Clone HIP8) | Biolegend | 303720 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD45Ra-PE-Cy7 antibody (Clone HI100) | Biolegend | 304126 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD66b-PE-Cy7 antibody (Clone G10F5) | Biolegend | 305116 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD7-FITC antibody (Clone CD7-6B7) | Biolegend | 343103 | Use 1:20 dilution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | Filter sterilize before use |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) powder with L-Glutamine | Gibco | 12100046 | Reconstitute 1 packet to make 1 L of DMEM media with sodium bicarbonate, 10% FBS & 1% penicillin & streptomycin |
| Fetal bovine serum, Australian source, heat inactivated | Omega Scientific | FB-22 Lot #609716 | |
| Human CD34 microbead kit | Miltenyi biotech | 130-046-702 | |
| Human Thrombopoietin (TPO), research grade | Miltenyi biotech | 130-094-011 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 50 ng/mL for both myeloid differentiation & stimulation medium |
| L-Glutamine | Omega Scientific | GS-60 | 2 mM concentration in stimulation medium |
| LS Columns | Miltenyi biotech | 130-042-401 | |
| MACS Multi stand | Miltenyi biotech | 130-042-303 | |
| MidiMACS magnetic separator | Miltenyi biotech | 130-042-302 | |
| MNC fractionation media (Ficol-Paque PLUS) | GE Healthcare Biosciences | 17-1440-03 | |
| MS-5 cells | Gift from the laboratory of Gay Crooks, UCLA | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Heat 800 mL of 1x PBS in a glass beaker on a stir plate in a chemical hood to ~65 °C. Add 10 g of paraformaldehyde powder. To completely dissolve the paraformaldehyde, raise the pH by adding 1 N NaOH. Cool and filter the solution and make up the volume to 1 L with 1x PBS. Adjust the pH to 7.2. |
| Penicillin & Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ml | |
| Poly-L lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | Make a 10 mg/mL stock in 1x PBS |
| Recombinant human erythropoietin-alpha (rHu EPO-α) | BioBasic | RC213-15 | Make a stock of 2000 units/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 4 units/mL for myeloid differentiation |
| Recombinant human fibronectin fragment (RetroNectin) | Takara | T100B | Use 20 µg/mL diluted in sterile 1x PBS to coat wells prior to stimulation of CD34+ HSCs. |
| Recombinant human Flt-3 ligand (rHu Flt-3L) | BioBasic | RC214-16 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium |
| Recombinant human interleukin-3 (rHu IL-3) | BioBasic | RC212-14 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 20 ng/mL in stimulation medium |
| Recombinant human stem cell factor (rHu SCF) | BioBasic | RC213-12 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium |
| Serum free medium (X-Vivo-15) | Lonza | 04-418Q | |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Wright-Giemsa stain, modified | Sigma-Aldrich | WG16-500 | Use according to manufacturer's instructions |
| Equipment | |||
| BD LSR II flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Centrifuge | Sorvall Legend RT | ||
| Light microscope | Olympus |
Riferimenti
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