Diferenciación panmieloide de la sangre de cordón humano derivada CD34+ Células hematopoyéticas del tallo y progenitor
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para la caracterización inmunophenotípica y la diferenciación inducida por citoquinas de la sangre de cordón umbilical derivada CD34+ células madre hematopoyéticas y células progenitoras a los cuatro linajes mieloides. Las aplicaciones de este protocolo incluyen investigaciones sobre el efecto de mutaciones de la enfermedad mieloide o moléculas pequeñas en la diferenciación mieloide de las células CD34+.
Abstract
La diferenciación ex vivo de células madre hematopoyéticas humanas es un modelo ampliamente utilizado para estudiar la hematopoyesis. El protocolo descrito aquí es para la diferenciación inducida por citoquinas de CD34+ células madre hematopoyéticas y células progenitoras a las cuatro células de linaje mieloides. CD34+ células están aisladas de la sangre del cordón umbilical humano y co-cultivadas con células estromales MS-5 en presencia de citoquinas. Se describe la caracterización inmunofenotípica de las células madre y progenitora, y las células de linaje mieloides diferenciadas. Usando este protocolo, las células CD34+ pueden ser incubadas con moléculas pequeñas o transducidas con lentivirus para expresar mutaciones de la enfermedad mieloide para investigar su impacto en la diferenciación mieloide.
Introduction
La diferenciación normal de las células madre hematopoyéticas (HSC) es fundamental para el mantenimiento de los niveles fisiológicos de todos los linajes de células sanguíneas. Durante la diferenciación, en una respuesta coordinada a las señales extracelulares, incluidos los factores de crecimiento y las citoquinas, los HSC dan lugar primero a células progenitoras multipotentes (MPP) que tienen potencial linfo-mieloides1,2,3 ,4 (Figura 1). Los PMP dan lugar a progenitores mieloides comunes (CMP) y progenitores linfoides comunes (CLP) que están restringidos al linaje. Los CLP se diferencian en los linajes linfoides compuestos por Células, T y células asesinas naturales. Los CMP generan los linajes mieloides a través de dos poblaciones de progenitores más restringidas, progenitores de eritroides de megacarilocitos (MEP) y progenitores de monocitos granulocitos (GMP). Los eurodiputados dan lugar a megacariocitos y eritrocitos, mientras que los GMP dan lugar a granulocitos y monocitos. Además de surgir a través de los CMP, se ha informado que los megacariocitostambién surgen directamente de los HSC o de los primeros PMP a través de vías no canónicas 5,6.
Las células hematopoyéticas del tallo y del progenitor (HSPC) se caracterizan por el marcador de superficie CD34 y la falta de marcadores específicos de linaje (Lin–). Otros marcadores de superficie que se emplean comúnmente para distinguir las poblaciones de Progenitores DeSC y mieloides incluyen CD38, CD45RA y CD1232 (Figura1). Los HSC y los MPP son Lin–/CD34+/CD38– y Lin–/CD34+/CD38+, respectivamente. Las poblaciones de progenitores comprometidos mieloides se distinguen por la presencia o ausencia de CD45RA y CD123. Los CMP son Lin–/CD34+/CD38+/CD45RA–/CD123lo, los GMP son Lin–/CD34+/CD38+/CD45RA+/CD123lo, y los MEP son Lin–/CD34+ /CD38+/CD45RA–/CD123–.
La población total decélulas madre y progenitora CD34 se puede obtener de la sangre del cordón umbilical humano (UCB), la médula ósea y la sangre periférica. CD34+ células constituyen 0.02% a 1.46% del total de células mononucleares (MNC) en UCB humano, mientras que su porcentaje varía entre 0.5% y 5.3% en la médula ósea y es mucho menor a 0.01% en sangre periférica7,8,9 . La capacidad proliferativa y el potencial de diferenciación de las células UCB derivadas CD34+ es significativamente mayor que la de la médula ósea o las células sanguíneas periféricas1,10, ofreciendo así una clara ventaja para obtener material suficiente para los análisis moleculares en combinación con la realización de caracterización inmunofenotípica y morfológica de las células durante la diferenciación.
La diferenciación ex vivo de la sangre del cordón umbilical derivada de CD34+ HSPCs es un modelo ampliamente aplicado para investigar los mecanismos normales de la hematopoyesis y la enfermedad hematopoyética. Cuando se cultiva con las citoquinas apropiadas, los UCB CD34+ HSCCP pueden ser inducidos a diferenciar a lo largo de los linajes mieloides o linfoides11,12,13,14,15 , 16. Aquí, describimos protocolos para el aislamiento y la caracterización inmunofenotípica de los CD34+ HSCCP de UCB humano, y para su diferenciación a las células de linaje mieloides. Este sistema de cultivo se basa en la diferenciación inducida por citoquinas de los HSCCP en presencia de células estromales MS-5 para imitar el microambiente en la médula ósea. Las condiciones de cultivo causan una expansión inicial de las células CD34 +, seguidas de su diferenciación a las células que expresan marcadores para las cuatro células de linaje mieloides, a saber, granulocitos (CD66b), monocitos (CD14), megacariocitos (CD41) y eritrocitos (CD235a). Las aplicaciones del protocolo CD34+ diferenciación celular incluyen estudios sobre mecanismos moleculares que regulan la hematopoyesis, y investigaciones sobre el impacto de mutaciones asociadas a la enfermedad mieloide y moléculas pequeñas en la auto-renovación y la auto-renovación y diferenciación de los HSCCP.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito aquí es adecuado para la diferenciación ex vivo de CD34+ HSCCP derivados ucB a los cuatro linajes mieloides. La incubación inicial con una mezcla de citoquinas que consiste en Células SCF, TPO, Flt3L e IL3 estimula las células CD34+. Posteriormente, la diferenciación se logra con un cóctel de SCF, IL3, Flt3L, EPO y TPO. En esta mezcla, SCF, IL3 y Flt3L son importantes para la supervivencia y proliferación de CD34+ HSCs. EPO y TPO promueven la diferenciación …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores quieren agradecer a Wendy Barrett, Rachel Caballero y Gabriella Ruiz de Maricopa Integrated Health Systems por las unidades de sangre de cordón de sin identificación y donado, Mrinalini Kala por la asistencia con la citometría de flujo, y Gay Crooks y Christopher Seet por consejos sobre la diferenciación mieloide ex vivo. Este trabajo fue apoyado por fondos a S.S. de los Institutos Nacionales de Salud (R21CA170786 y R01GM127464) y la Sociedad Americana contra el Cáncer (la Beca de Investigación Institucional 74-001-34-IRG). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.
Materials
| 0.4% Trypan blue solution | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | Dilute working stock to 0.2% in sterile 1x PBS |
| 0.5 M UltraPure Ethylene diamine tetra acetic acid, pH 8.0 | Gibco | 15575-038 | |
| 10x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14185052 | Dilute to 1x with sterile distilled water & pH to 7.2 |
| 2.5% Trypsin, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15090046 | Dilute working stock to 1x with sterile 1x PBS |
| 30 µm Pre-separation filters | Miltenyi biotech | 130-041-407 | |
| 35% sterile Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7979 | |
| 7-AAD | Biolegend | 420404 | Used as a live/dead stain to eliminate dead cells from FACS analysis |
| Anti-human CD10-FITC antibody (Clone HI10a) | Biolegend | 312207 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD11b-FITC (activated) antibody (Clone CBRM1/5) | Biolegend | 301403 | Use 1:5 dilution |
| Anti-human CD123-APC antibody (Clone 6H6) | Biolegend | 306012 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD14-PE antibody (Clone M5E2) | Biolegend | 301806 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD19-FITC antibody (Clone 4G7) | BD Biosciences | 347543 | Use 1:5 dilution |
| Anti-human CD235a-APC antibody (Clone GA-R2 (HIR2)) | BD Biosciences | 551336 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD235a-FITC antibody (Clone HIR2) | Biolegend | 306609 | Use 1:50 dilution |
| Anti-human CD34-APC-Cy7 antibody (Clone 581) | Biolegend | 343514 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD38-PE antibody (Clone HIT2) | Biolegend | 303506 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD3-FITC antibody (Clone UCHT1) | Biolegend | 300405 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD41a-PerCP-Cy5.5 antibody (Clone HIP8) | Biolegend | 303720 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD45Ra-PE-Cy7 antibody (Clone HI100) | Biolegend | 304126 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD66b-PE-Cy7 antibody (Clone G10F5) | Biolegend | 305116 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD7-FITC antibody (Clone CD7-6B7) | Biolegend | 343103 | Use 1:20 dilution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | Filter sterilize before use |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) powder with L-Glutamine | Gibco | 12100046 | Reconstitute 1 packet to make 1 L of DMEM media with sodium bicarbonate, 10% FBS & 1% penicillin & streptomycin |
| Fetal bovine serum, Australian source, heat inactivated | Omega Scientific | FB-22 Lot #609716 | |
| Human CD34 microbead kit | Miltenyi biotech | 130-046-702 | |
| Human Thrombopoietin (TPO), research grade | Miltenyi biotech | 130-094-011 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 50 ng/mL for both myeloid differentiation & stimulation medium |
| L-Glutamine | Omega Scientific | GS-60 | 2 mM concentration in stimulation medium |
| LS Columns | Miltenyi biotech | 130-042-401 | |
| MACS Multi stand | Miltenyi biotech | 130-042-303 | |
| MidiMACS magnetic separator | Miltenyi biotech | 130-042-302 | |
| MNC fractionation media (Ficol-Paque PLUS) | GE Healthcare Biosciences | 17-1440-03 | |
| MS-5 cells | Gift from the laboratory of Gay Crooks, UCLA | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Heat 800 mL of 1x PBS in a glass beaker on a stir plate in a chemical hood to ~65 °C. Add 10 g of paraformaldehyde powder. To completely dissolve the paraformaldehyde, raise the pH by adding 1 N NaOH. Cool and filter the solution and make up the volume to 1 L with 1x PBS. Adjust the pH to 7.2. |
| Penicillin & Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ml | |
| Poly-L lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | Make a 10 mg/mL stock in 1x PBS |
| Recombinant human erythropoietin-alpha (rHu EPO-α) | BioBasic | RC213-15 | Make a stock of 2000 units/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 4 units/mL for myeloid differentiation |
| Recombinant human fibronectin fragment (RetroNectin) | Takara | T100B | Use 20 µg/mL diluted in sterile 1x PBS to coat wells prior to stimulation of CD34+ HSCs. |
| Recombinant human Flt-3 ligand (rHu Flt-3L) | BioBasic | RC214-16 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium |
| Recombinant human interleukin-3 (rHu IL-3) | BioBasic | RC212-14 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 20 ng/mL in stimulation medium |
| Recombinant human stem cell factor (rHu SCF) | BioBasic | RC213-12 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium |
| Serum free medium (X-Vivo-15) | Lonza | 04-418Q | |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Wright-Giemsa stain, modified | Sigma-Aldrich | WG16-500 | Use according to manufacturer's instructions |
| Equipment | |||
| BD LSR II flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Centrifuge | Sorvall Legend RT | ||
| Light microscope | Olympus |
Riferimenti
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