Descriviamo un metodo per visualizzare gli IEL con etichettatura GFP utilizzando l'imaging intravitale dell'intestino piccolo murino mediante microscopia confocale del disco rotante invertita. Questa tecnica consente il monitoraggio delle cellule vive all'interno della mucosa fino a 4 h e può essere utilizzata per studiare una varietà di interazioni immuno-epiteliali intestinali.
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Articolo metodologico
Imaging intravitale dei linfociti intraettali a Murine Small Intestine
In questo articolo
Sommario
Abstract
I linfociti intraeliali che esprimono il recettore delle cellule T (IEL) svolgono un ruolo chiave nella sorveglianza immunitaria dell'epitelio intestinale. A causa in parte della mancanza di un ligando definitivo per il recettore delle cellule T, la nostra comprensione della regolazione dell'attivazione di IEL e della loro funzione in vivo rimane limitata. Ciò richiede lo sviluppo di strategie alternative per interrogare i percorsi di segnalazione coinvolti nella regolazione della funzione IEL e la reattività di queste cellule al microambiente locale. Anche se gli IEL sono ampiamente compresi per limitare la traslocazione degli agenti patogeni, l'uso dell'imaging intravitale è stato fondamentale per comprendere le dinamiche spatiotemporali delle interazioni IEL/epiteliali a stato costante e in risposta a patogeni invasivi. Qui, presentiamo un protocollo per la visualizzazione del comportamento migratorio IEL nella piccola mucosa intestinale di un topo reporter del cellulare T GFP utilizzando la microscopia laser confocale del disco rotante invertita. Sebbene la profondità massima di imaging di questo approccio sia limitata rispetto all'uso della microscopia a scansione laser a due fotoni, la microscopia laser confocale a disco rotante offre il vantaggio dell'acquisizione di immagini ad alta velocità con fotobleaching ridotto e Photodamage. Utilizzando il software di analisi delle immagini 4D, il comportamento di sorveglianza delle cellule T e le loro interazioni con le cellule vicine possono essere analizzati in seguito alla manipolazione sperimentale per fornire ulteriori informazioni sull'attivazione e il funzionamento dell'IEL all'interno della mucosa intestinale.
Introduzione
I linfociti intraeliali (IEL) si trovano all'interno dell'epitelio intestinale e si trovano sia lungo la membrana del seminterrato che tra celle epiteliali adiacenti nello spazio intercellulare laterale1. C'è circa un IEL per ogni 5-10 cellule epiteliali; questi IEL servono come sentinelle per fornire la sorveglianza immunitaria della grande distesa della barriera epiteliale intestinale2. Gli IEL che esprimono il recettore delle cellule T (TCR) costituiscono fino al 60% della popolazione totale di IEL nell'intestino piccolo murno. Studi condotti su topi carenti di cellule T dimostrano un ruolo in gran parte protettivo di....
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Protocollo
Tutti gli studi sono stati condotti in una struttura accreditata dall'Associazione della valutazione e dell'accreditamento della cura degli animali di laboratorio (AALAC) secondo i protocolli approvati dalla Rutgers New Jersey Medical School Comparative Medicine Resources.
1. Preparazione del mouse
NOT: La seguente procedura, compresa la preparazione e l'intervento chirurgico, prenderà 30-40 min. Prima dell'intervento chirurgico, accenderà il microscopio e riscalderà l'incubatrice chiusa al microscopio a 37 gradi centigradi.
- Eseguire esperimenti su mouse TcrdEGFP di 8-10 settima....
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Risultati
Utilizzando l'imaging intravitale dei topi reporter TcrdEGFP, abbiamo già dimostrato che gli iEL s'esibiscono con un comportamento di sorveglianza dinamica, in cui pattugliano l'epitelio migrando lungo la membrana del seminterrato e nello spazio intercellulare laterale (LIS) a stato (Figura 2, Filmato 1).
Questo approccio può essere utilizzato anche per valutare come l'inibizione di specifiche vie di segnalazione cellulare e/o recettori influenza .......
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Discussione
Lo sviluppo di tecniche di microscopia intravitale ha fornito un'opportunità senza precedenti per osservare la riorganizzazione delle strutture subcellulari8,9,22, interazioni cellule-cellule12, 25 e comportamento migratorio cellulare13,14,15,16
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è supportato da NIH R21 AI143892, New Jersey Health Foundation Grant, Busch Biomedical Grant (KLE). Ringraziamo Madeleine Hu per la sua assistenza nella modifica del manoscritto e nella fornitura dei dati riportati nei risultati rappresentativi.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piatto da 35 mm, n. 1,5 Vetrino coprioggetti | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Alexa Fluor 633 Hydrazide | Invitrogen | A30634 | |
| BD PrecisionGlide Aghi ipodermici - 27 G | Thermo Fisher Scientific | 14-826-48 | |
| BD Siringa sterile con punta scorrevole - 1 mL | Thermo Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| BD Siringa per tubercolina | Thermo Fisher Scientific | 14-829-9 | |
| Forbici da dissezione | Thermo Fisher Scientific | 08-940 | |
| Elettrocauterizzazione | Thermo Fisher Scientific | 50822501 | |
| Camera di incubazione chiusa | OKOLAB | Microscopio | |
| Aghi per occhi, misura #3; 1/2 cerchio, punta conica, 12 mm lunghezza corda | Roboz | RS-7983-3 | |
| Hank's Soluzione salina bilanciata | Sigma-Aldrich | 55037C | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
| Imaris (v. 9.2.1) con moduli Start, Track, XT | Software | Bitplane | |
| Microscopio Leica DMi8 | |||
| IQ3 (v. 3.6.3) | Andor | Software | |
| Ketamina | Putney | Anesthesia | |
| Kimwipes | VWR | 21905-026 | |
| McPherson-Vannas forbici 3" (7,5 cm) Lunga 5 x 0,15 mm Dritta Sharp | Roboz | RS-5600 | |
| Sutura chirurgica non assorbibile, bobina di seta, pinza Fisher | Scientific | NC0798934 | |
| 4,25" (11 cm) Punta liscia ad angolo lungo da 1,2 mm | Roboz | RS-5228 | |
| Puralube Unguento veterinario | Dechra | Unguento lubrificante per gli occhi | |
| Disco rotante Yokogawa CSU-W1 con obiettivo a immersione in glicerolo 63x 1.3 N.A. HC PLAN APO, fotocamera EMCCD iXon Life 888, laser a diodi da 405 nm, laser DPSS da 488 nm, laser a diodi da 640 nm | Andor | Sistema confocale | |
| Anestesia | xilazina | Akorn |
Riferimenti
- Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 11 (7), 445-456 (2011).
- Hu, M. D., Edelblum, K. L. Sentinels at the frontline: the role ....
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Ristampe e permessi
