뮤린 소장에서 상피 내 림프구의 활력 영상
Summary
우리는 거꾸로 회전 디스크 공초점 현미경 검사법에 의해 뮤린 소장의 내장 영상을 사용하여 GFP 표지된 γδ IELs를 구상하는 방법을 기술합니다. 이 기술은 최대 4 시간 동안 점막 내의 살아있는 세포의 추적을 가능하게하고 장 내 면역 상피 상호 작용의 다양한 조사하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
γδ T 세포 수용체 (γδ IEL)를 발현하는 상피 내 림프구는 장 상피의 면역 감시에 중요한 역할을한다. γδ T 세포 수용체에 대한 확실한 리간드의 부족으로 인해, γδ IEL 활성화및 생체 내의 이들의 기능의 조절에 대한 우리의 이해는 제한적이다. 이것은 γδ IEL 기능 및 국부적인 미세 환경에 대한 이 세포의 반응성에 관여하는 신호 통로를 심문하는 대체 전략의 개발을 필요로 합니다. γδ IELs는 병원체 전좌를 제한하기 위하여 넓게 이해되더라도, intravital 화상 진찰의 사용은 안정상태에서 및 침략적인 병원체에 응하여 IEL/상피 상호 작용의 좌측 시간 역학을 이해하는 것이 중요했습니다. 본 명세서에서, 우리는 역회전 디스크 공초점 레이저 현미경을 사용하여 GFP γδ T 세포 리포터 마우스의 소장 점막에서 IEL 철새 거동을 시공하기 위한 프로토콜을 제시한다. 이 접근법의 최대 이미징 깊이는 2광자 레이저 스캐닝 현미경 검사법의 사용에 비해 제한적이지만, 회전 디스크 공초점 레이저 현미경 은 광표백을 감소시키고 고속 이미지 수집의 이점을 제공합니다. 사진 손상. 4D 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 T 세포 감시 동작과 이웃 세포와의 상호 작용을 실험 조작 후 분석하여 장 점막 내IEL 활성화 및 기능에 대한 추가 적인 통찰력을 제공합니다.
Introduction
상피 내 림프구(IEL)는 장 상피 내에 위치하며, 지하막을 따라 그리고 세포간 공간 내의 인접 한 상피 세포 사이에모두 발견된다 1. 5-10개의 상피 세포마다 약 1개의 IEL이 있습니다. 이러한 ILS는 장 상피 장벽2의 큰 창공의 면역 감시를 제공하는 센티넬역할을 한다. γδ T 세포 수용체(TCR)를 발현하는 ILs는 뮤린 소장에서 총 IEL 집단의 최대 60%를 포함한다. γδ T 세포 결핍 마우스에 대한 연구는 장 손상, 염증 및 감염에 대한 응답으로이들 세포의 크게 보호 역할을 입증 3,4,5. Tcrd 녹아웃 마우스 6의생성에도 불구하고, γδ IEL 생물학에 대한 우리의 이해는 γδ TCR에 의해 인식된 리간드가 아직 확인되지 않았다는 사실로 인해 부분적으로 제한적으로 남아 있다7. 그 결과, 이러한 세포 집단을 연구하는 도구의 부족으로 인해 생리적 및 병리학적 조건 하에서 γδ TCR 활성화 및 기능의 역할을 조사하기가 어려워졌다. 이러한 격차를 해소하기 위해, 우리는 γδ IEL 기능및 생체 내 외부 자극에 대한 반응성에 대한 추가적인 통찰력을 제공하는 수단으로 γδ IEL 철새 행동과 이웃 장세포와의 상호 작용을 시각화하는 라이브 이미징 기술을 개발했습니다.
지난 10 년 동안, intravital 화상 진찰은 상피 세포 흘리기 8, 상피 장벽 기능 의조절을 포함하여 장 생물학의 다중 양상에 관련되었던 분자 사건의 우리의 이해를 현저하게 확장했습니다9 ,10,발광 내용의 골수성 세포 샘플링11,12,및 숙주 미생물 상호 작용11,13,14,15,16 . IEL 생물학의 맥락에서, 내활력 현미경 검사법의 사용은 IEL 운동성의 시공간역학 및 감시 행동을 중재하는 요인에 빛을 비추었습니다13,14,15, 16. 핵 GFP 발현17에의해 γδ IeLs를 표시하는 TcrdH2BeGFP (TcrdEGFP) 기자 마우스의 개발은 γδ ILs가 상피 내 의 높은 운동성이며 미생물에 반응하는 독특한 감시 행동을 나타낸다는 것을 밝혔습니다. 감염17,13,14. 최근에는, 또 다른 γδ T 세포 리포터 마우스가 전체 세포(18)의 시각화를 허용하도록 세포질에서GFP를 발현하는 (Tcrd-GDL)이 개발되었다. 유사한 방법론은 IEL 운동성19,20의역학에 G 단백질 결합 수용체(GPCR)-18 및 -55와 같은 특정 케모카인 수용체의 요구사항을 조사하기 위해 사용되어 왔다. 세포 특이적 리포터가 없는 경우, CD8α에 대한 형광 공액 항체를 생체내IEL 운동성을 시각화하고 추적하는 데 사용되었으며,20. 2광자 레이저 스캐닝 현미경은 일반적으로 intravital 화상 진찰을 위해 사용되지만, 회전 디스크 공초점 레이저 현미경의 사용은 최소한의 배경 잡음으로 고속 및 고해상도 멀티 채널 이미지를 캡처하는 독특한 장점을 제공합니다. 이 기술은 장 점막의 복잡한 미세 환경 내에서 면역 / 상피 상호 작용의 시공간 역학을 해명하는 데 이상적입니다. 더욱이, 다양한 형질전환 및/또는 녹아웃 마우스 모델의 사용을 통해, 이러한 연구는 장 내 면역 및/또는 상피 세포 기능의 분자 조절에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
사내 현미경 기술의 발달은 세포 내 구조의 재구성을 관찰 할수있는 전례없는 기회를 제공했다 8,9,22,세포 – 세포 상호 작용12, 25 및 세포 이동 거동13,14,15,16,26 그렇지 …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH R21 AI143892, 뉴저지 건강 재단 보조금, 부시 생물 의학 보조금 (KLE)에 의해 지원됩니다. 우리는 원고를 편집하고 대표 결과에 표시된 데이터를 제공하는 그녀의 도움 마들렌 후 감사합니다.
Materials
| 35mm dish, No. 1.5 Coverslip | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Alexa Fluor 633 Hydrazide | Invitrogen | A30634 | |
| BD PrecisionGlide Hypodermic needles – 27g | Thermo Fisher Scientific | 14-826-48 | |
| BD Slip Tip Sterile Syringe – 1 ml | Thermo Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| BD Tuberculin Syringe | Thermo Fisher Scientific | 14-829-9 | |
| Dissecting scissors | Thermo Fisher Scientific | 08-940 | |
| Electrocautery | Thermo Fisher Scientific | 50822501 | |
| Enclosed incubation chamber | OKOLAB | Microscope | |
| Eye Needles, Size #3; 1/2 Circle, Taper Point, 12 mm Chord Length | Roboz | RS-7983-3 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | 55037C | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
| Imaris (v. 9.2.1) with Start, Track, XT modules | Bitplane | Software | |
| Inverted DMi8 | Leica | Microscope | |
| IQ3 (v. 3.6.3) | Andor | Software | |
| Ketamine | Putney | Anesthesia | |
| Kimwipes | VWR | 21905-026 | |
| McPherson-Vannas scissors 3” (7.5 cm) Long 5X0.15mm Straight Sharp | Roboz | RS-5600 | |
| Non-absorbable surgical suture, Silk Spool, Black Braided | Fisher Scientific | NC0798934 | |
| Nugent Forceps 4.25” (11 cm) Long Angled Smooth 1.2mm Tip | Roboz | RS-5228 | |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | Lubricating Eye Ointment | |
| Spinning disk Yokogawa CSU-W1 with a 63x 1.3 N.A. HC PLAN APO glycerol immersion objective, iXon Life 888 EMCCD camera, 405 nm diode laser, 488 nm DPSS laser, 640 nm diode laser | Andor | Confocal system | |
| Xylazine | Akorn | Anesthesia |
Riferimenti
- Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 11 (7), 445-456 (2011).
- Hu, M. D., Edelblum, K. L. Sentinels at the frontline: the role of intraepithelial lymphocytes in inflammatory bowel disease. Current Pharmacology Reports. 3 (6), 321-334 (2017).
- Chen, Y., Chou, K., Fuchs, E., Havran, W. L., Boismenu, R. Protection of the intestinal mucosa by intraepithelial gamma delta T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (22), 14338-14343 (2002).
- Swamy, M., et al. Intestinal intraepithelial lymphocyte activation promotes innate antiviral resistance. Nature Communications. 6, 7090 (2015).
- Dalton, J. E., et al. Intraepithelial gammadelta+ lymphocytes maintain the integrity of intestinal epithelial tight junctions in response to infection. Gastroenterology. 131 (3), 818-829 (2006).
- Mombaerts, P., et al. Spontaneous development of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice. Cell. 75 (2), 274-282 (1993).
- Willcox, B. E., Willcox, C. R. gammadelta TCR ligands: the quest to solve a 500-million-year-old mystery. Nature Immunology. 20 (2), 121-128 (2019).
- Marchiando, A. M., et al. The epithelial barrier is maintained by in vivo tight junction expansion during pathologic intestinal epithelial shedding. Gastroenterology. 140 (4), e1201-e1202 (2011).
- Marchiando, A. M., et al. Caveolin-1-dependent occludin endocytosis is required for TNF-induced tight junction regulation in vivo. Journal of Cell Biology. 189 (1), 111-126 (2010).
- Yu, D., et al. MLCK-dependent exchange and actin binding region-dependent anchoring of ZO-1 regulate tight junction barrier function. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 107 (18), 8237-8241 (2010).
- Chieppa, M., Rescigno, M., Huang, A. Y., Germain, R. N. Dynamic imaging of dendritic cell extension into the small bowel lumen in response to epithelial cell TLR engagement. Journal of Experimental Medicine. 203 (13), 2841-2852 (2006).
- McDole, J. R., et al. Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine. Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).
- Edelblum, K. L., et al. Dynamic migration of gammadelta intraepithelial lymphocytes requires occludin. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (18), 7097-7102 (2012).
- Edelblum, K. L., et al. gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Migration Limits Transepithelial Pathogen Invasion and Systemic Disease in Mice. Gastroenterology. 148 (7), 1417-1426 (2015).
- Hu, M. D., et al. Epithelial IL-15 Is a Critical Regulator of gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Motility within the Intestinal Mucosa. Journal of Immunology. 201 (2), 747-756 (2018).
- Hoytema van Konijnenburg, D. P., et al. Intestinal Epithelial and Intraepithelial T Cell Crosstalk Mediates a Dynamic Response to Infection. Cell. 171 (4), 783-794 (2017).
- Prinz, I., et al. Visualization of the earliest steps of gammadelta T cell development in the adult thymus. Nature Immunology. 7 (9), 995-1003 (2006).
- Sandrock, I., et al. Genetic models reveal origin, persistence and non-redundant functions of IL-17-producing gammadelta T cells. Journal of Experimental Medicine. 215 (12), 3006-3018 (2018).
- Wang, X., Sumida, H., Cyster, J. G. GPR18 is required for a normal CD8alphaalpha intestinal intraepithelial lymphocyte compartment. Journal of Experimental Medicine. 211 (12), 2351-2359 (2014).
- Sumida, H., et al. GPR55 regulates intraepithelial lymphocyte migration dynamics and susceptibility to intestinal damage. Sci Immunol. 2 (18), (2017).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2 (2), (2011).
- Watson, A. J., et al. Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers. Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).
- Lodolce, J. P., et al. IL-15 receptor maintains lymphoid homeostasis by supporting lymphocyte homing and proliferation. Immunity. 9 (5), 669-676 (1998).
- Ma, L. J., Acero, L. F., Zal, T., Schluns, K. S. Trans-presentation of IL-15 by intestinal epithelial cells drives development of CD8alphaalpha IELs. Journal of Immunology. 183 (2), 1044-1054 (2009).
- Knoop, K. A., et al. Antibiotics promote the sampling of luminal antigens and bacteria via colonic goblet cell associated antigen passages. Gut Microbes. 8 (4), 400-411 (2017).
- Sujino, T., et al. Tissue adaptation of regulatory and intraepithelial CD4(+) T cells controls gut inflammation. Science. 352 (6293), 1581-1586 (2016).
- Zhang, B., et al. Differential Requirements of TCR Signaling in Homeostatic Maintenance and Function of Dendritic Epidermal T Cells. Journal of Immunology. 195 (9), 4282-4291 (2015).
- Chennupati, V., et al. Intra- and intercompartmental movement of gammadelta T cells: intestinal intraepithelial and peripheral gammadelta T cells represent exclusive nonoverlapping populations with distinct migration characteristics. Journal of Immunology. 185 (9), 5160-5168 (2010).
- Kolesnikov, M., Farache, J., Shakhar, G. Intravital two-photon imaging of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 421, 73-80 (2015).
