Измерение относительной секреции инсулина с помощью совместно секретной суррогатной Люциферазы
Summary
Этот протокол описывает, как выполнять быстрые недорогие анализы люциферазы на средней пропускной связи с использованием инсулина связанных Гауссия luciferase в качестве прокси для секреции инсулина из бета-клеток. Ассеи может быть выполнен с большинством люминесценции пластины читателей и многоканальных пипетки.
Abstract
Выполнение антител на основе анализов для секретированных инсулина после образца сбора обычно требует нескольких часов в день анализ времени и может быть дорогим, в зависимости от конкретного анализа. Засекреченные luciferase анализы ускорить результаты и снизить стоимость анализов на образец существенно. Здесь мы представляем относительно недоиспользованный подход к оценке инсулина секреторной активности из поджелудочной железы и клеток с помощью Gaussia luciferase генетически вставлены в C-пептид. Во время протеолитической обработки проинсулина, C-пептид высечены выпуская люциферазу в инсулин секреторной везикулы, где он совместно секретируется с инсулином. Результаты могут быть получены в течение нескольких минут после сбора образцов из-за скорости анализов люциферазы. Ограничением проверки является то, что это относительное измерение секреции инсулина, а не абсолютная количественная оценка. Тем не менее, этот протокол является экономичным, масштабируемым, и может быть выполнен с помощью большинства стандартных считывателей люминесценции. Аналоговые и цифровые многоканальные пипетки облегчают несколько этапов ассеи. Множество различных экспериментальных вариаций могут быть протестированы одновременно. После того, как целенаправленный набор условий определяются, концентрации инсулина должны быть измерены непосредственно с помощью антител на основе анализов со стандартными кривыми, чтобы подтвердить результаты анализлю люциферазы.
Introduction
Представленный здесь метод позволяет быстро и доступно из-за секреции инсулина из генетически модифицированной бета-клеточной линии быстро и доступно в формате 96-хорошо. Ключом к этому протоколу является модифицированная версия инсулина с естественно-секретной luciferase Gaussia (GLuc, No 18 kDa) вставлена (см. Рисунок 1) в C-пептид для генерации инсулина-Gaussia (InsGLuc)1,2. Другие более крупные белки, такие как GFP (No 25 kDa), были успешно вставлены в C-пептид инсулина и выставлены ожидаемые пост-трансляционной обработки от проинсулин-GFP инсулина и GFP-C-пептид3,4. Для проведения в этом протоколе, GLuc был кодон-оптимизирован для выражения млекопитающих и две мутации были введены для повышения свечения, как кинетика5,6. Несколько комбинаций и репликации лечебных заболеваний могут быть легко протестированы в формате 96-хорошо пластины и результаты секреции могут быть получены сразу же после эксперимента.
Основным преимуществом, как отмечалось ранее2, является низкая стоимость этого luciferase основе секреции измерения (злот; $ 0,01 /хорошо), который отличает его от относительно более высоких затрат и технических аспектов фермент-связанных иммуносорбентных анализов (ELISAs) ( В качестве антитела на основе антител на основе антител, основанных на 2 долларах, и однородной флуоресценции (HTRF) или других рецензировании, говорится о том, что они будут передаваться из-под другого спора о рецензировании (FRET). По сравнению с этими антителами на основе анализов, которые измеряют концентрацию инсулина, ссылаясь на стандартную кривую, Анализ InsGLuc измеряет секреторную деятельность как относительное сравнение с контролем скважин на пластине. По этой причине каждый эксперимент требует включения надлежащего контроля. Это различие является компромиссом, позволяющим проводить быстрые и недорогие измерения. Тем не менее, было доказано, что секреция InsGLuc сильно коррелирует с секрецией инсулина, измеренной ELISA1,2. Эта технология была масштабирована для высокой пропускной связи скрининга1,2,7 и привела к выявлению новых модуляторов секреции инсулина, включая ингибитор канала калия, приложенный к напряжению7 а также натуральный ингибитор продукта функции клеток, хромомицин A28. Использование InsGLuc является наиболее подходящим для исследователей, которые планируют постоянно тестировать множество различных условий лечения для их воздействия на секрецию инсулина. В последующих экспериментах необходимо повторить ключевые выводы в родительской линии клеток, а оптимально в мурин или человеческих островках, и измерить секрецию инсулина с помощью анализа на основе антител.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом мы представляем метод для быстрой оценки глюкозостимулированных реакций на секрецию инсулина от клеток MIN6. Для лучших ответов в асссе важно сеять клетки MIN6 при надлежащей плотности и позволить им стать 85-95% слив. Это улучшает реакцию клеток на глюкозу из-за улучшения контактов кл…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят всех нынешних и бывших сотрудников лаборатории Кобб за ценную работу и дискуссии, и Дионн Уэйр за административную помощь. Майкл Калват поддерживается Фондом исследований диабета для несовершеннолетних SRA-2019-702-З-Р. Эта работа стала возможной через NIH R37 DK34128 и Уэлч Фонд Грант I1243 Мелани Кобб. Ранние части этой работы были также поддержаны NIH F32 DK100113 Майклу Калвату.
Materials
| Cell culture materials | |||
| rIns-GLuc stable MIN6 cells | Parental MIN6 cell line stably expressing pcDNA3.1+rInsp-Ins-eGLuc and maintained in 250 ug/ml G418 | ||
| DMEM | Sigma | D6429 | 4.5 g/L glucose media |
| fetal bovine serum, heat-inactivated | Sigma | F4135 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fisher Scientific | SV30010 | |
| beta-mercaptoethanol | Thermo-Fisher Scientific | BP 176-100 | |
| glutamine | Thermo-Fisher Scientific | BP379-100 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T3924-500 | |
| G418 | Gold Biotechnology | G418-10 | Stock solution 250 mg/mL in water. Freeze aliquots at -20C. |
| T75 tissue culture flasks | Fisher Scientific | 07-202-000 | |
| 96 well tissue culture plates | Celltreat | 229196 | |
| Reagent reservoirs (50 mL) | Corning | 4870 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secretion assay reagents | |||
| BSA (RIA grade) | Thermo-Fisher Scientific | 50-146-952 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| KCl | Thermo-Fisher Scientific | P217-500 | |
| NaCl | Thermo-Fisher Scientific | S271-3 | |
| Hepes, pH 7.4 | Thermo-Fisher Scientific | 50-213-365 | |
| NaHCO3 | Thermo-Fisher Scientific | 15568414 | |
| MgCl2 | Thermo-Fisher Scientific | M9272-500G | |
| CaCl2 | Sigma | C-7902 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Optional drugs for stimulation experiments | |||
| Diazoxide | Sigma | D9035 | Stock solution: 50 mM in 0.1N NaOH. Add equal amount of 0.1N HCl to any buffer where diazoxide is added. |
| epinephrine (bitartrate salt) | Sigma | E4375 | Stock solution: 5 mM in water |
| PMA (phorbol 12-myristate) | Sigma | P1585 | Stock solution: 100 µM in DMSO |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guassia assay materials | |||
| Disodium phosphate (Na2HPO4) | Thermo-Fisher Scientific | S374-500 | |
| Glycerol | Thermo-Fisher Scientific | G334 | |
| Sodium Bromide | Thermo-Fisher Scientific | AC44680-1000 | |
| EDTA | Thermo-Fisher Scientific | AC44608-5000 | Stock solution: 0.5 M pH 8 |
| Tris base | RPI | T60040-1000.0 | Stock solution: 1 M pH 8 |
| Ascorbic Acid | Fisher Scientific | AAA1775922 | US Patent US7718389 suggested ascorbate can increase coelenterazine stability. |
| Na2SO3 | Sigma | S0505-250G | US Patent US8367357 suggested sulfite may decrease background due to BSA |
| Coelenterazine (native) | Nanolight / Prolume | 3035MG | Stock solution: 1 mg/ml in acidified MeOH (2.36 mM) |
| OptiPlate-96, White Opaque 96-well Microplate | Perkin Elmer | 6005290 | Any opaque white 96 well plate should be sufficient. Clear bottom plates will also work, however some signal will be lost. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Synergy H1 Hybrid plate reader or equivalent | BioTek | 8041000 | A plate reader with luminescence detection and 96-well plate capabilities is required. |
| 8-channel VOYAGER Pipette (50-1250 µL) | Integra | 4724 | An automated multichannel pipette is extremely useful for rapid addition of luciferase reagents and plating cells in 96 well format |
| 8-channel 200 µL pipette | Transferpette S 20-200 µL | 2703710 |
Riferimenti
- Kalwat, M. A., et al. Insulin promoter-driven Gaussia luciferase-based insulin secretion biosensor assay for discovery of beta-cell glucose-sensing pathways. ACS Sensors. 1 (10), 1208-1212 (2016).
- Burns, S. M., et al. High-throughput luminescent reporter of insulin secretion for discovering regulators of pancreatic Beta-cell function. Cell Metabolism. 21 (1), 126-137 (2015).
- Rajan, S., et al. In vitro processing and secretion of mutant insulin proteins that cause permanent neonatal diabetes. American Journal of Physiology – Endocrinology and Metabolism. 298 (3), E403-E410 (2010).
- Watkins, S., et al. Imaging Secretory Vesicles by Fluorescent Protein Insertion in Propeptide Rather Than Mature Secreted Peptide. Traffic. 3 (7), 461-471 (2002).
- Welsh, J. P., Patel, K. G., Manthiram, K., Swartz, J. R. Multiply mutated Gaussia luciferases provide prolonged and intense bioluminescence. Biochemical Biophysical Research Communications. 389 (4), 563-568 (2009).
- Tannous, B. A., Kim, D. E., Fernandez, J. L., Weissleder, R., Breakefield, X. O. Codon-optimized Gaussia luciferase cDNA for mammalian gene expression in culture and in vivo. Molecular Therarpy. 11 (3), 435-443 (2005).
- Burns, S. M., Wagner, B. K., Vetere, A. Compounds and methods for regulating insulin secretion. World patent. , (2018).
- Kalwat, M. A., et al. Chromomycin A2 potently inhibits glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta cells. Journal of General Physiology. , (2018).
- Luft, C., et al. Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs. BMC Biochemistry. 15 (1), 14 (2014).
- Ohmiya, Y., Wu, C. Stabilizing composition and stabilizing method of coelenterazine solution for high-throughput measurement of luciferase activity. U.S. Patent. , (2010).
- Tannous, B. A. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (4), 582-591 (2009).
- Wurdinger, T., et al. A secreted luciferase for ex vivo monitoring of in vivo processes. Nature Methods. 5 (2), 171-173 (2008).
- Henquin, J. C. Triggering and amplifying pathways of regulation of insulin secretion by glucose. Diabetes. 49 (11), 1751-1760 (2000).
- Mourad, N. I., Nenquin, M., Henquin, J. C. Amplification of insulin secretion by acetylcholine or phorbol ester is independent of beta-cell microfilaments and distinct from metabolic amplification. Molecular & Cellular Endocrinology. 367 (1-2), 11-20 (2013).
- Straub, S. G., Sharp, G. W. Evolving insights regarding mechanisms for the inhibition of insulin release by norepinephrine and heterotrimeric G proteins. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 302 (12), C1687-C1698 (2012).
- Cheng, K., et al. High passage MIN6 cells have impaired insulin secretion with impaired glucose and lipid oxidation. PLoS One. 7 (7), e40868 (2012).
- Head, W. S., et al. Connexin-36 Gap Junctions Regulate In Vivo First- and Second-Phase Insulin Secretion Dynamics and Glucose Tolerance in the Conscious. Diabetes. 61 (7), 1700-1707 (2012).
- Benninger, R. K. P., Head, W. S., Zhang, M., Satin, L. S., Piston, D. W. Gap junctions and other mechanisms of cell-cell communication regulate basal insulin secretion in the pancreatic islet. The Journal of Physiology. 589 (22), 5453-5466 (2011).
- Konstantinova, I., et al. EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets. Cell. 129 (2), 359-370 (2007).
- Jaques, F., et al. Dual effect of cell-cell contact disruption on cytosolic calcium and insulin secretion. Endocrinology. 149 (5), 2494-2505 (2008).
- Calabrese, A., et al. Connexin 36 Controls Synchronization of Ca2+ Oscillations and Insulin Secretion in MIN6 Cells. Diabetes. 52 (2), 417-424 (2003).
- Bielefeld-Sevigny, M. AlphaLISA immunoassay platform- the "no-wash" high-throughput alternative to ELISA. Assay and Drug Development Technologies. 7 (1), 90-92 (2009).
- Aslanoglou, D., George, E. W., Freyberg, Z. Homogeneous Time-resolved Forster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
- Rafati, A., Zarrabi, A., Abediankenari, S., Aarabi, M., Gill, P. Sensitive colorimetric assay using insulin G-quadruplex aptamer arrays on DNA nanotubes coupled with magnetic nanoparticles. Royal Sociecy Open Science. 5 (3), 171835 (2018).
- Hulleman, J. D., Brown, S. J., Rosen, H., Kelly, J. W. A high-throughput cell-based Gaussia luciferase reporter assay for identifying modulators of fibulin-3 secretion. Journal of Biomolecular Screening. 18 (6), 647-658 (2013).
- Frank, J. A., et al. Optical tools for understanding the complexity of beta-cell signalling and insulin release. Nature Reviews Endocrinology. 14 (12), 721-737 (2018).
- Zhu, S., et al. Monitoring C-Peptide Storage and Secretion in Islet beta-Cells In Vitro and In Vivo. Diabetes. 65 (3), 699-709 (2016).
