Génération d'un foie orthotopic Human Uveal Melanoma Xenograft Platform in Immunodeficient Mice
Summary
Des modèles de souris de xénogreffe de xénogreffe de mélanome uastatique de foie humain orthotopic ont été créés utilisant des techniques orthotopic chirurgicales d’implantation orthotopic avec le morceau patient-dérivé de tumeur et les techniques d’injection d’aiguille avec les lignes humaines cultivées de cellules de mélanome uveal.
Abstract
Au cours des dernières décennies, les tumeurs xénogreffes dérivées du patient ou les lignées cellulaires humaines cultivées ont été de plus en plus reconnues comme des modèles plus représentatifs pour étudier les cancers humains chez les souris immunodéficientes que les cellules humaines établies traditionnelles. lignes in vitro. Récemment, des modèles orthotopiquement implantés de xénogreffe de tumeur patient-dérivé (PDX) chez les souris ont été développés pour mieux reproduire des dispositifs des tumeurs patientes. On s’attend à ce qu’un modèle orthotopic de souris de xénogreffe de foie soit une plate-forme utile de recherche de cancer, fournissant des perspicacités dans la biologie de tumeur et la thérapie de drogue. Cependant, l’implantation orthotopic de tumeur de foie est généralement compliquée. Ici nous décrivons nos protocoles pour l’implantation orthotopic des tumeurs uvéal de mélanome uveal foie-métastatique patient-dérivées. Nous avons cultivé les lignées de cellules uvéales métastatiques de mélanome de foie humain dans les souris immunodéficientes. Les protocoles peuvent avoir comme conséquence des taux de succès technique uniformément élevés utilisant une technique orthotopic chirurgicale d’implantation avec des morceaux de tumeur uveal de mélanome patient-dérivée ou une technique d’injection d’aiguille avec la ligne humaine cultivée de cellules. Nous décrivons également des protocoles pour le balayage de CT pour détecter des tumeurs intérieures de foie et pour des techniques de ré-implantation utilisant des tumeurs cryoconservées pour réaliser le re-engraftment. Ensemble, ces protocoles fournissent une meilleure plate-forme pour les modèles orthotopiques de souris de tumeur de foie du mélanome uvéal métastatique de foie dans la recherche translationnelle.
Introduction
Le mélanome uvéal est la tumeur maligne intraoculaire la plus commune parmi des adultes dans le monde occidental. Au cours des 50 dernières années, l’incidence du mélanome uvéal (5,1 cas par million) est restée stable aux États-Unis1,2. Le mélanome uvéal provient des mlanocytes dans l’iris, le corps ciliaire, ou la choroïde, et c’est une maladie extrêmement mortelle quand il développe la métatasie. Le taux de mortalité des patients présentant la métastase uvéal de mélanome était 80% à 1 an et 92% à 2 ans après diagnostic initial des métastases. Le temps entre le diagnostic des métastases et la mort est généralement court, moins de 6 mois, sans égard à la thérapie3,4. Le cancer se propage dans le sang et tend à métastaser principalement le foie (89-93%)4,5. Un modèle efficace de souris est urgent nécessaire pour davantage d’investigation du mélanome uvéal foie-métastatique. Pour la recherche translationnelle, il y a une demande claire pour produire un modèle métastatique de souris de mélanome métastatique foie-localisé.
On s’attend à ce que les modèles de souris de xénogreffe de tumeur patient-dérivé (PDX) fournissent des stratégies individualisées de médecine. Ces modèles pourraient être prédictifs des résultats cliniques, être utiles pour l’évaluation préclinique de drogue, et être employés pour des études biologiques des tumeurs6. Les modèles représentatifs de PDX sont des souris xénogreffes ectopiques implantées par tumeur, qui ont la tumeur aux emplacements sous-cutanés. La plupart des chercheurs peuvent faire la chirurgie pour l’implantation sous-cutanée sans pratique spéciale7,8. Ils peuvent également surveiller les tumeurs sous-cutanées facilement. Bien que les modèles sous-cutanés PDX est devenu populaire dans la phase de recherche, ils ont quelques obstacles à passer à l’utilisation pratique. L’implantation sous-cutanée force les tumeurs patient-dérivées à engraft à un microenvironnement différent de l’origine de tumeur, de sorte qu’elle mène à l’échec d’engraftment et à la croissance lente de tumeur 9,10,11, 12,13,14. L’engraftment orthotopic peut être une approche plus idéale et rationnelle pour un modèle de PDX parce qu’il emploie le même organe que la tumeur originale15,16.
Récemment, nous avons développé des protocoles pour les techniques orthotopic d’implantation chirurgicale des tumeurs uveal de mélanome et uvéal de foie-dérivées patient-dérivées et des techniques d’injection d’aiguille avec une ligne de cellules uvéal uveal de mélanome de foie-métastatique de culture dans NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) souris17,18. Les protocoles se traduisent par des taux de réussite technique toujours élevés. Nous avons également établi des techniques de balayage de CT qui sont utiles pour détecter des tumeurs intérieures de foie, et nous avons développé la ré-implantation des tumeurs cryopréservées dans la plate-forme de PDX. Nous avons constaté que les modèles de xénogreffe de tumeur de mélanome uvéal maintiennent les caractéristiques de la tumeur originale de foie de patient, y compris leurs dispositifs histopathologiques et moléculaires. Ensemble, ces techniques fournissent une meilleure plate-forme pour les modèles de tumeur orthotopic de foie pour le mélanome uvéal dans la recherche translationnelle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les modèles actuels de xénogreffe orthotopique sont laborieux, longs et coûteux à créer. Les modèles orthotopiques de souris de xénogreffe de tumeur pour le cancer du foie ont été établis il y a plus de deux décennies19,20,21. Cependant, cette technique est compliquée et nécessite l’utilisation d’équipements spéciaux, tels qu’un porte-aiguilles et 6-0 à 8-0 sutures fines au microscope. La tumeur et le tissu hépa…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants à M. Ohara, K. Saito et M. Terai d’avoir examiné le manuscrit. Les auteurs reconnaissent l’examen critique pour l’aide éditoriale et anglaise de ce manuscrit par le Dr R. Sato au Fox Chase Cancer Center. Les travaux décrits ci-contre ont été soutenus par le Bonnie Kroll Research Fund, le Mark Weinzierl Research Fund, le Eye Melanoma Research Fund de l’Université Thomas Jefferson, la Osaka Community Foundation et le JSPS KAKENHI Grant Number JP 18K15596 à Osaka City Université. Les études menées dans le laboratoire du Dr A. Aplin ont été appuyées par la subvention des NIH R01 GM067893. Ce projet a également été financé par un Dean’s Transformative Science Award, un Thomas Jefferson University Programmatic Initiative Award.
Materials
| Materials, tissues and animals | |||
| Buprenorphine | |||
| CO2 tank | |||
| Cryomedium | |||
| Exitron nano 12000 (Alkaline earth metal-based nanoparticle contrast agent) | Miltenyl Biotec | 130-095-700 | |
| HBSS 1X, with calcium & magnesium | Corning | 21-020-CM | |
| Human liver metastatic uveal melanoma cell line | |||
| Human uveal melanoma tissue in the liver | All tissue handling should be done in a Biosafety Level 2 hood. Be careful when working with human tissue; always use gloves and avoid direct skin contact. Assume patients may have been infected with HIV or other highly transmissible organisms. Do not process samples known to carry infections. | ||
| Iodine | |||
| Isoflurane | Purdue Products | 67618-150-17 | |
| Isopropanol | Fisher scientific | A416-1 | Avoid direct contact to skin and eye and inhalation of anesthetic agent. |
| Liquid nitrogen | |||
| Matrigel HC | BD | 354248 | |
| NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | Jackson Lab | 5557 | 4 to 8 weeks old |
| PBS 1X, without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CM | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-013-CV | |
| Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol) | Nice-Pak products | B603 | |
| 4% paraformaldehyde phosphate buffer solution | Wako | 163-20145 | |
| 70% Ethyl alcohol solution | Fisher Scientific | 04-355-122 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Absorbable hemostat | Johnson and Johnson | 63713-0019-61 | |
| Autoclave | |||
| Body weight measure | |||
| Cautery | Bovie Medical | MC-23009 | |
| Cell counter | |||
| Centrifuzer | |||
| Cotton swab | |||
| Cryo freezing container | NALGENE | 5100-0001 | |
| Cryotube | SARSTEDT | 72.379 | |
| Curved scissors | World Precision Instruments | 503247 | |
| Curved ultrafine forceps | World Precision Instruments | 501302 | |
| Fabric sheet | |||
| Freezer | |||
| F/AIR Filter Canister | Harvard Apparatus | 600979 | |
| Heating pad | |||
| Isoflurane vaporizer | Artisan Scientific | 66317-1 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Liquid nitrogen jar | Thermo Fisher Scientific | 2123 | |
| Micro-CT scan | Siemens | ||
| Needle holder | World Precision Instruments | 501246 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Pipette | |||
| Spray bottle | |||
| Sterile hood | Biosafety level 2 cabinet | ||
| Sterile No.11 scalpel | AD Surgical | A300-11-0 | |
| Straight forceps | World Precision Instruments | 14226 | |
| Surgical drape | |||
| Tail vein restrainer | Braintree Scientific | TV-150-STD | |
| Water bath | |||
| 1 ml TB syringe with 27-gauge needle | BD | 309623 | |
| 1.7 ml tube | Bioexpress | C-3260-1 | |
| 5-0 PDO Suture | AD Surgical | S-D518R13 | |
| 15 mL conical tubes | AZER SCIENTIFIC | ES-9152N | |
| 27-gauge needle | BD | 780301 | |
| 27-gauge needle | Hamilton | 7803-01 | |
| 50 mL conical tubes | AZER SCIENTIFIC | ES-9502N | |
| 50 µl micro syringe | BD | 80630 | |
| 50 µl micro syringe | Hamilton | 7655-01 | |
| 100 mL container | Fisher Scientific | 12594997 | |
| 200μl tip |
Riferimenti
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