הדור של מלנומה האדם Uveal האנושי פלטפורמת Xהשתל בעכברים חיסוני
Summary
אורתופון האדם גרורות הכבד uveal מלנומה מבע מודלים העכבר נוצרו באמצעות שיטות כירורגי אורתוקפית עם קטע הגידול המטופל נגזר וטכניקות הזרקת מחט עם הגוף האנושי תרבותי שורות מלנומה.
Abstract
בעשורים האחרונים, תת-עורי מושתל החולה הנגזר גידולים מבע או שורות התאים האנושיים האדם מוכר יותר ויותר כמודלים מייצגים יותר ללמוד סרטן האדם עכברים חיסוני מאשר תא אנושי מסורתי הוקמה קווי מבחנה לאחרונה, אורתולמריחה על החולה מושתל הגידול מבע (pdx) מודלים בעכברים פותחו כדי לשכפל יותר תכונות של גידולים החולה. הכבד אורתובסיס מודל העכבר מקבל השתל צפוי להיות פלטפורמת מחקר שימושי לסרטן, מתן תובנות לתוך ביולוגיה של הגידול וטיפול בסמים. אולם, השתלת הגידול אורתוטופית מסובכת בדרך כלל. כאן אנו מתארים את הפרוטוקולים שלנו עבור השתלת הנושא האורתודפית של החולה-נגזר הכבד-מלנומה וגרורתית גידולים בסרטן. אנחנו מתורבתים האדם מתורבת uveal מלנומה מסרטן קווי לתוך עכברים חיסוני. הפרוטוקולים יכולים לגרום בעקביות שיעורי הצלחה טכנית גבוהה באמצעות טכניקה השרשה כירורגית אורתודופית עם נתחי החולה הנגזר מלנומה סרטן או טכניקה הזרקת מחט עם קו הגוף האנושי מתורבת. אנו גם לתאר פרוטוקולים עבור סריקת CT כדי לזהות גידולים בכבד הפנים לבין טכניקות מחדש השרשה באמצעות גידולים קריואופרשמורות כדי להשיג מחדש. יחד, פרוטוקולים אלה מספקים פלטפורמה טובה יותר עבור מודלים של העכבר הגידול אורתופפית של מלנומה גרורתית בכבד במחקר טרנסלtional.
Introduction
מלנומה uveal היא הגידול הנפוץ ביותר התוך העינית ממאיר בקרב מבוגרים בעולם המערבי. במהלך 50 השנים האחרונות, השכיחות של מלנומה uveal (5.1 מקרים למיליון) נשאר יציב בארצות הברית1,2. מלנומה uveal נובע מלנוציטים ב איריס, גוף סיליארי, או choroid, וזה מחלה קטלנית ביותר כאשר הוא מפתח גרורות. שיעור התמותה של חולים עם גרורות מלנומה uveal היה 80% בשנה 1 ו 92% ב 2 שנים לאחר האבחנה הראשונית של גרורות. הזמן בין האבחנה של גרורות ומוות הוא בדרך כלל קצר, פחות מ 6 חודשים, בלי להתייחס לטיפול3,4. הסרטן מתפשט דרך הדם ונוטה להיות גרורות נגד הכבד (89-93%)4,5. מודל העכבר האפקטיבי הוא הצורך בדחיפות לחקירה נוספת של מלנומה הכבד-גרורתי מסרטן. עבור מחקר translational, יש דרישה ברורה כדי ליצור מודל העכבר מלנומה גרורתית מסרטן הכבד uveal.
החולה-נגזר הגידול מבע (pdx) מודלים העכבר צפויים לספק אסטרטגיות תרופות מותאמת אישית. מודלים אלה עשויים להיות ניבוי של תוצאות קליניות, להיות שימושי עבור הערכת תרופות טרום קלינית, ולשמש למחקרים ביולוגיים של גידולים6. הנציג pdx מודלים הם למריחה על הגידול עכברים מבע, אשר יש גידול באתרים תת עורית. רוב החוקרים יכולים לעשות ניתוח להשתלה תת עורית ללא אימון מיוחד7,8. הם יכולים גם לפקח על גידולים תת עורית בקלות. למרות מודלים PDX תת עורית הפך פופולרי בשלב המחקר, יש להם כמה מכשולים במעבר לשימוש מעשי. השרשה תת-עורית כוחות החולה-נגזר גידולים לתוך מיקרופט בסביבה שונה ממקור הגידול, כך שהוא מוביל לכשל בתיאום וצמיחה איטית הגידול 9,10,11, .12,13,14 אורתופפית מהווה גישה אידיאלית ורציונלית לדגם pdx, משום שהוא משתמש באותו איבר כמו הגידול המקורי15,16.
לאחרונה, פיתחנו פרוטוקולים עבור טכניקות השרשה כירורגי השתלת החולה-נגזר בכבד-מלנומה בסרטן ושיטות הזרקת מחט טכניקות עם הגוף האנושי-גרורתי בכבד האדם מלנומה ומסרטן קו בהנהון. Cg-prkdcscidIl2rgtm1Wjl/szj (nsg) עכברים17,18. הפרוטוקולים כתוצאה בעקביות שיעורי הצלחה טכנית גבוהה. כמו כן הקמנו CT סריקת טכניקות שימושיות כדי לזהות גידולים בכבד הפנים, ופיתחנו מחדש השרשה של גידולים בתוך פלטפורמת PDX. מצאנו כי uveal מלנומה גידול מודלים מבע לשמור על המאפיינים של גידול בכבד החולה המקורי, כולל תכונות histopathological ומולקולרית שלהם. יחד, טכניקות אלה מספקים פלטפורמה טובה יותר עבור מודלים הגידול הכבד הנושא עבור מלנומה uveal במחקר טרנסלtional.
Protocol
Representative Results
Discussion
הדגמים הנוכחיים של מודלים של השתל הנוכחי הינם עתירי עבודה, זמן רב, ויקרים ליצירה. אורתובנושא הגידול מבע מודלים עכבר לסרטן הכבד הוקמו לפני יותר משני עשורים19,20,21. עם זאת, טכניקה זו היא מסובכת ודורשת שימוש בציוד מיוחד, כגון בעל מחט מיקרו ו 6-0 כ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו אסירי תודה על מסיה אוהרה, ק. סאיטו, ומסיה טראי, על סקירת כתב היד. המחברים מכירים ביקורת קריטית עבור העריכה והעזרה האנגלית של כתב יד זה על ידי ד ר… סאטו בבית הסרטן פוקס צ’ייס מרכז. העבודה שתוארה בזאת היתה נתמכת על ידי קרן בוני קרול מחקר, הקרן מחקר ויינזירופ, קרן מלנומה לחקר העין באוניברסיטת תומס ג’פרסון, קרן הקהילה של אוסקה, ו-JSPS KAKENHI גרנט מספר JP 18K15596 באוסקה סיטי אוניברסיטת. מחקרים במעבדה של ד ר א. אפלין תמכו על ידי NIH גרנט R01 GM067893. פרויקט זה מומן גם על ידי פרס המדע הטרנספורמטיבי של דיקן, פרס היוזמה התוכניתית של אוניברסיטת תומס ג’פרסון.
Materials
| Materials, tissues and animals | |||
| Buprenorphine | |||
| CO2 tank | |||
| Cryomedium | |||
| Exitron nano 12000 (Alkaline earth metal-based nanoparticle contrast agent) | Miltenyl Biotec | 130-095-700 | |
| HBSS 1X, with calcium & magnesium | Corning | 21-020-CM | |
| Human liver metastatic uveal melanoma cell line | |||
| Human uveal melanoma tissue in the liver | All tissue handling should be done in a Biosafety Level 2 hood. Be careful when working with human tissue; always use gloves and avoid direct skin contact. Assume patients may have been infected with HIV or other highly transmissible organisms. Do not process samples known to carry infections. | ||
| Iodine | |||
| Isoflurane | Purdue Products | 67618-150-17 | |
| Isopropanol | Fisher scientific | A416-1 | Avoid direct contact to skin and eye and inhalation of anesthetic agent. |
| Liquid nitrogen | |||
| Matrigel HC | BD | 354248 | |
| NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | Jackson Lab | 5557 | 4 to 8 weeks old |
| PBS 1X, without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CM | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-013-CV | |
| Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol) | Nice-Pak products | B603 | |
| 4% paraformaldehyde phosphate buffer solution | Wako | 163-20145 | |
| 70% Ethyl alcohol solution | Fisher Scientific | 04-355-122 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Absorbable hemostat | Johnson and Johnson | 63713-0019-61 | |
| Autoclave | |||
| Body weight measure | |||
| Cautery | Bovie Medical | MC-23009 | |
| Cell counter | |||
| Centrifuzer | |||
| Cotton swab | |||
| Cryo freezing container | NALGENE | 5100-0001 | |
| Cryotube | SARSTEDT | 72.379 | |
| Curved scissors | World Precision Instruments | 503247 | |
| Curved ultrafine forceps | World Precision Instruments | 501302 | |
| Fabric sheet | |||
| Freezer | |||
| F/AIR Filter Canister | Harvard Apparatus | 600979 | |
| Heating pad | |||
| Isoflurane vaporizer | Artisan Scientific | 66317-1 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Liquid nitrogen jar | Thermo Fisher Scientific | 2123 | |
| Micro-CT scan | Siemens | ||
| Needle holder | World Precision Instruments | 501246 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Pipette | |||
| Spray bottle | |||
| Sterile hood | Biosafety level 2 cabinet | ||
| Sterile No.11 scalpel | AD Surgical | A300-11-0 | |
| Straight forceps | World Precision Instruments | 14226 | |
| Surgical drape | |||
| Tail vein restrainer | Braintree Scientific | TV-150-STD | |
| Water bath | |||
| 1 ml TB syringe with 27-gauge needle | BD | 309623 | |
| 1.7 ml tube | Bioexpress | C-3260-1 | |
| 5-0 PDO Suture | AD Surgical | S-D518R13 | |
| 15 mL conical tubes | AZER SCIENTIFIC | ES-9152N | |
| 27-gauge needle | BD | 780301 | |
| 27-gauge needle | Hamilton | 7803-01 | |
| 50 mL conical tubes | AZER SCIENTIFIC | ES-9502N | |
| 50 µl micro syringe | BD | 80630 | |
| 50 µl micro syringe | Hamilton | 7655-01 | |
| 100 mL container | Fisher Scientific | 12594997 | |
| 200μl tip |
Riferimenti
- Aronow, M. E., Topham, A. K., Singh, A. D. Uveal Melanoma: 5-Year Update on Incidence, Treatment, and Survival (SEER 1973-2013). Ocular Oncology and Pathology. 4 (3), 145-151 (2018).
- Krantz, B. A., Dave, N., Komatsubara, K. M., Marr, B. P., Carvajal, R. D. Uveal melanoma: epidemiology, etiology, and treatment of primary disease. Clinical Ophthalmology. 11, 279-289 (2017).
- Gragoudas, E. S., et al. Survival of patients with metastases from uveal melanoma. Ophthalmology. 98 (3), 383-389 (1991).
- Diener-West, M., et al. Development of metastatic disease after enrollment in the COMS trials for treatment of choroidal melanoma: Collaborative Ocular Melanoma Study Group Report No. 26. Archives of Ophthalmology. 123 (12), 1639-1643 (2005).
- Collaborative Ocular Melanoma Study Group. Assessment of metastatic disease status at death in 435 patients with large choroidal melanoma in the Collaborative Ocular Melanoma Study (COMS): COMS report no. 15. Archives of Ophthalmology. 119 (5), 670-676 (2001).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Kim, M. P., et al. Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice. Nature Protocols. 4 (11), 1670-1680 (2009).
- Némati, F., et al. Establishment and characterization of a panel of human uveal melanoma xenografts derived from primary and/or metastatic tumors. Clinical Cancer Research. 16 (8), 2352-2362 (2010).
- Wilmanns, C., et al. Modulation of Doxorubicin sensitivity and level of p-glycoprotein expression in human colon-carcinoma cells by ectopic and orthotopic environments in nude-mice. International Journal of Oncology. 3 (3), 413-422 (1993).
- Kang, Y., et al. Proliferation of human lung cancer in an orthotopic transplantation mouse model. Experimental and Therapeutic. 1 (3), 471-475 (2010).
- Fichtner, I., et al. Establishment of patient-derived non-small cell lung cancer xenografts as models for the identification of predictive biomarkers. Clinical Cancer Research. 14 (20), 6456-6468 (2008).
- Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays. Clinical Cancer Research. 13 (13), 3989-3998 (2007).
- Bergamaschi, A., et al. Molecular profiling and characterization of luminal-like and basal-like in vivo breast cancer xenograft models. Molecular Oncology. 3 (5-6), 469-482 (2009).
- Ho, K. S., Poon, P. C., Owen, S. C., Shoichet, M. S. Blood vessel hyperpermeability and pathophysiology in human tumour xenograft models of breast cancer: a comparison of ectopic and orthotopic tumours. BMC Cancer. 12, 579 (2012).
- Hoffman, R. M. Patient-derived orthotopic xenografts: better mimic of metastasis than subcutaneous xenografts. Nature Reviews Cancer. 15 (8), 451-452 (2015).
- Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 85 (2), 217-221 (2009).
- Ozaki, S., et al. Establishment and Characterization of Orthotopic Mouse Models for Human Uveal MelanomaHepatic Colonization. American Journal of Pathology. 186 (1), 43-56 (2016).
- Kageyama, K., et al. Establishment of an orthotopic patient-derived xenograft mouse model using uveal melanomahepatic metastasis. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 145 (2017).
- Fu, X. Y., Besterman, J. M., Monosov, A., Hoffman, R. M. Models of human metastatic colon cancer in nude mice orthotopically constructed by using histologically intact patient specimens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (20), 9345-9349 (1991).
- Rashidi, B., et al. An orthotopic mouse model of remetastasis of human colon cancer liver metastasis. Clinical Cancer Research. 6 (6), 2556-2561 (2000).
- Fan, Z. C., et al. Real-time monitoring of rare circulating hepatocellular carcinoma cells in an orthotopic model by in vivo flow cytometry assesses resection on metastasis. Ricerca sul cancro. 72 (10), 2683-2691 (2012).
- Jacob, D., Davis, J., Fang, B. Xenograftictumor modelsinmiceforcancer research, atechnical review. Gene Therapy and Molecular Biology. 8, 213-219 (2004).
- Ahmed, S. U., et al. Generation of subcutaneous and intrahepatic human hepatocellular carcinoma xenografts in immunodeficient mice. Journal of Visualized Experiments. 25 (79), e50544 (2013).
- Kim, M., et al. Generation of humanized liver mouse model by transplant of patient-derived fresh human hepatocytes. Transplantation Proceedings. 46 (4), 1186-1190 (2014).
- Lavender, K. J., Messer, R. J., Race, B., Hasenkrug, K. J. Production of bone marrow, liver, thymus (BLT) humanized mice on the C57BL/6 Rag2(-/-)γc(-/-)CD47(-/-) background. Journal of Immunological Methods. 407, 127-134 (2014).
- Boll, H., et al. Micro-CT based experimental liver imaging using a nanoparticulate contrast agent: a longitudinal study in mice. PLoS One. 6 (9), e25692 (2011).
- Zhao, X., et al. Global gene expression profiling confirms the molecular fidelity of primary tumor-based orthotopic xenograft mouse models of medulloblastoma. Neuro-Oncology. 14 (5), 574-583 (2012).
- Rubio-Viqueira, B., et al. An in vivo platform for translational drug development in pancreatic cancer.Clinical. Ricerca sul cancro. 12 (15), 4652-4661 (2006).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Ricerca sul cancro. 73 (17), 5315-5319 (2013).
- Alkema, N. G., et al. Biobanking of patient and patient-derived xenograft ovarian tumour tissue: efficient preservation with low and high fetal calf serum based methods. Scientific Reports. 6 (5), 14495 (2015).
