Generazione di una piattaforma di Melanoma Uvenoma Uvenoft umano del fegato in topi immunodeficienti
Summary
I modelli murini xenoma uvea-hettale del fegato umano ortotopico sono stati creati utilizzando tecniche di impianto ortotopico chirurgico con pezzi tumorali derivati dal paziente e tecniche di iniezione di aghi con linee cellulari di melanoma uveale umano coltivate.
Abstract
Negli ultimi decenni, i tumori xenotrapianto derivati dal paziente sottocutanei o le linee cellulari umane coltivate sono stati sempre più riconosciuti come modelli più rappresentativi per studiare i tumori umani in topi immunodeficienti rispetto alle cellule umane tradizionali stabilite linee in vitro. Recentemente, i modelli di xenotrapianto tumorale derivato (PDX) di tipo paziente impiantato ortotopicamente nei topi sono stati sviluppati per replicare meglio le caratteristiche dei tumori dei pazienti. Si prevede che un modello murino xenotrapianto ortotopico del fegato sia un’utile piattaforma di ricerca sul cancro, fornendo informazioni sulla biologia del tumore e sulla terapia farmacologica. Tuttavia, l’impianto del tumore ortotopico del fegato è generalmente complicato. Qui descriviamo i nostri protocolli per l’impianto ortotopico di tumori del melanoma uveoma-metastatico del epatico derivati dal paziente. Abbiamo coltivato linee cellulari del melanoma uveoma metastatico del fegato umano in topi immunodeficienti. I protocolli possono portare a tassi di successo tecnico costantemente elevati utilizzando una tecnica di impianto ortotema chirurgico con pezzi di tumore del melanoma uveale derivato dal paziente o una tecnica di iniezione di ago con linea cellulare umana coltivata. Descriviamo anche protocolli per la scansione TC per rilevare i tumori interni del fegato e per le tecniche di reimpianto utilizzando tumori crioconservati per ottenere una ri-innesto. Insieme, questi protocolli forniscono una migliore piattaforma per i modelli di topo tumorale ortotopico del tumore epatico del melanoma uveale metastatico del fegato nella ricerca traslazionale.
Introduction
Il melanoma uveale è il tumore maligno intraoculare più comune tra gli adulti del mondo occidentale. Negli ultimi 50 anni, l’incidenza del melanoma uveale (5,1 casi per milione) è rimasta stabile negli Stati Uniti1,2. Il melanoma uveale deriva dai melanociti nell’iride, nel corpo ciliario o nella contuita, ed è una malattia estremamente letale quando sviluppa metastasi. Il tasso di mortalità dei pazienti con metastasi del melanoma uveale era dell’80% a 1 anno e del 92% a 2 anni dopo la diagnosi iniziale delle metastasi. Il tempo tra la diagnosi delle metastasi e la morte è in genere breve, meno di 6 mesi, senza riguardo alla terapia3,4. Il cancro si diffonde attraverso il sangue e tende a metastasi dominante al fegato (89-93%)4,5. Un modello murino efficace è urgentemente necessario per ulteriori indagini sul melanoma uveale metastatico al fegato. Per la ricerca traslazionale, c’è una chiara richiesta di generare un modello di topo melanoma uveaallo metastatico localizzato in fegato.
Si prevede che i modelli murini xenograft tumorale derivato dal paziente (PDX) forniscano strategie di medicina individualizzata. Questi modelli potrebbero essere predittivi degli esiti clinici, essere utili per la valutazione preclinica dei farmaci ed essere utilizzati per studi biologici sui tumori6. I modelli PDX rappresentativi sono i topi xenografti impiantati dal tumore, che hanno il tumore nei siti sottocutanei. La maggior parte dei ricercatori può fare un intervento chirurgico per l’impianto sottocutaneo senza pratica speciale7,8. Possono anche monitorare facilmente i tumori sottocutanei. Anche se i modelli sottocutanei PDX sono diventati popolari nella fase di ricerca, hanno alcuni ostacoli nel passaggio all’uso pratico. L’impianto sottocutaneo costringe i tumori derivati dal paziente ad innestare in un microambiente diverso da quello del tumore, in modo che porti all’insufficienza di innesto e alla lenta crescita del tumore 9,10,11, 12,13,14. L’innesto ortotopico può essere un approccio più ideale e razionale per un modello PDX perché utilizza lo stesso organo del tumore originale15,16.
Recentemente, abbiamo sviluppato protocolli per tecniche di impianto ortotopico chirurgico di tumori del melanoma uveoma metastatico del paziente e tecniche di iniezione dell’ago con una linea di cellule del melanoma uveostatico epatico-metastatico umano in NOD. Cg-Prkdcha scrittoil il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) topi17,18. I protocolli si traducono in tassi di successo tecnico costantemente elevati. Abbiamo anche stabilito tecniche di tac che sono utili per rilevare i tumori interni del fegato, e abbiamo sviluppato il reimpianto di tumori crioconservati nella piattaforma PDX. Abbiamo scoperto che i modelli di xenotrapianto del melanoma uveale mantengono le caratteristiche del tumore epatico originale del paziente, comprese le loro caratteristiche istopatologiche e molecolari. Insieme, queste tecniche forniscono una migliore piattaforma per i modelli di tumore ortotopico del fegato per il melanoma uveale nella ricerca traslazionale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gli attuali modelli di xenotrapianto ortotopico sono laboriosi, dispendiosi in termini di tempo e costosi da creare. Modelli di topoxenotrapianto tumore ortotopico per il cancro del fegato sono stati stabiliti più di due decenni fa19,20,21. Tuttavia, questa tecnica è complicata e richiede l’uso di attrezzature speciali, come un supporto micro-aghi e da 6-0 a 8-0 suture fini al microscopio. Il tumore e il tessuto epatico normal…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati a M. Ohara, K. Saito e M. Terai, per aver esaminato il manoscritto. Gli autori riconoscono la revisione critica per l’assistenza editoriale e inglese di questo manoscritto da parte del Dr. R. Sato al Fox Chase Cancer Center. Il lavoro qui descritto è stato sostenuto dal Bonnie Kroll Research Fund, dal Mark Weinzierl Research Fund, dal Eye Melanoma Research Fund presso la Thomas Jefferson University, dalla Osaka Community Foundation e dal JSPS KAKENHI Grant Number JP 18K15596 a Osaka City Università. Gli studi nel laboratorio del Dr. A. Aplin sono stati supportati dalla sovvenzione NIH R01 GM067893. Questo progetto è stato anche finanziato da un Dean’s Transformative Science Award, un Thomas Jefferson University Programmatic Initiative Award.
Materials
| Materials, tissues and animals | |||
| Buprenorphine | |||
| CO2 tank | |||
| Cryomedium | |||
| Exitron nano 12000 (Alkaline earth metal-based nanoparticle contrast agent) | Miltenyl Biotec | 130-095-700 | |
| HBSS 1X, with calcium & magnesium | Corning | 21-020-CM | |
| Human liver metastatic uveal melanoma cell line | |||
| Human uveal melanoma tissue in the liver | All tissue handling should be done in a Biosafety Level 2 hood. Be careful when working with human tissue; always use gloves and avoid direct skin contact. Assume patients may have been infected with HIV or other highly transmissible organisms. Do not process samples known to carry infections. | ||
| Iodine | |||
| Isoflurane | Purdue Products | 67618-150-17 | |
| Isopropanol | Fisher scientific | A416-1 | Avoid direct contact to skin and eye and inhalation of anesthetic agent. |
| Liquid nitrogen | |||
| Matrigel HC | BD | 354248 | |
| NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | Jackson Lab | 5557 | 4 to 8 weeks old |
| PBS 1X, without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CM | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-013-CV | |
| Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol) | Nice-Pak products | B603 | |
| 4% paraformaldehyde phosphate buffer solution | Wako | 163-20145 | |
| 70% Ethyl alcohol solution | Fisher Scientific | 04-355-122 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Absorbable hemostat | Johnson and Johnson | 63713-0019-61 | |
| Autoclave | |||
| Body weight measure | |||
| Cautery | Bovie Medical | MC-23009 | |
| Cell counter | |||
| Centrifuzer | |||
| Cotton swab | |||
| Cryo freezing container | NALGENE | 5100-0001 | |
| Cryotube | SARSTEDT | 72.379 | |
| Curved scissors | World Precision Instruments | 503247 | |
| Curved ultrafine forceps | World Precision Instruments | 501302 | |
| Fabric sheet | |||
| Freezer | |||
| F/AIR Filter Canister | Harvard Apparatus | 600979 | |
| Heating pad | |||
| Isoflurane vaporizer | Artisan Scientific | 66317-1 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Liquid nitrogen jar | Thermo Fisher Scientific | 2123 | |
| Micro-CT scan | Siemens | ||
| Needle holder | World Precision Instruments | 501246 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Pipette | |||
| Spray bottle | |||
| Sterile hood | Biosafety level 2 cabinet | ||
| Sterile No.11 scalpel | AD Surgical | A300-11-0 | |
| Straight forceps | World Precision Instruments | 14226 | |
| Surgical drape | |||
| Tail vein restrainer | Braintree Scientific | TV-150-STD | |
| Water bath | |||
| 1 ml TB syringe with 27-gauge needle | BD | 309623 | |
| 1.7 ml tube | Bioexpress | C-3260-1 | |
| 5-0 PDO Suture | AD Surgical | S-D518R13 | |
| 15 mL conical tubes | AZER SCIENTIFIC | ES-9152N | |
| 27-gauge needle | BD | 780301 | |
| 27-gauge needle | Hamilton | 7803-01 | |
| 50 mL conical tubes | AZER SCIENTIFIC | ES-9502N | |
| 50 µl micro syringe | BD | 80630 | |
| 50 µl micro syringe | Hamilton | 7655-01 | |
| 100 mL container | Fisher Scientific | 12594997 | |
| 200μl tip |
Riferimenti
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