免疫不全マウスにおける肝直交細胞性ヒトうveal黒色腫異種移植プラットフォームの生成
Summary
オルソトピックヒト肝転移性ブドウ球色黒色移植マウスモデルは、培養ヒトブドウ色腫細胞株を用いた患者由来腫瘍チャンクおよび針注射技術を用いた外科的オルトトピック移植技術を用いて作成された。
Abstract
ここ数十年、皮下移植患者由来異種移植片腫瘍または培養ヒト細胞株は、従来の確立されたヒト細胞よりも免疫不全マウスにおけるヒト癌を研究する代表的なモデルとしてますます認識されているインビトロの行。近年、マウスに直交移植患者由来腫瘍異種移植片(PDX)モデルが開発されており、患者腫瘍の特徴をより良く複製することが挙げられる。肝臓の正接異種移植片マウスモデルは、腫瘍生物学と薬物療法に関する洞察を提供する有用な癌研究プラットフォームであることが期待される。しかしながら、肝臓の正形トピック腫瘍移植は一般に複雑である。ここでは、患者由来肝転移性うveveal黒色腫腫瘍のオルソトピック移植のためのプロトコルについて説明する。ヒト肝転移性ブドウ球色黒色腫細胞株を免疫不全マウスに培養した。このプロトコルは、患者由来のブドウ色腫腫瘍の塊を持つ外科的オルトトピック移植技術または培養ヒト細胞株を用いた針注入技術のいずれかを用いて、一貫して高い技術的成功率をもたらすことができます。また、内部肝腫瘍を検出するCTスキャンや、再移植を達成するために凍結保存腫瘍を用いた再移植技術についても説明する。一緒に, これらのプロトコルは、翻訳研究における肝転移性ウVEVE性黒色腫の肝直芽性腫瘍マウスモデルのためのより良いプラットフォームを提供します。
Introduction
うびよ黒色腫は、西洋世界の成人の間で最も一般的な眼内悪性腫瘍である。過去50年間、米国1、2では、ウベル黒色腫(100万人当たり5.1例)の発生率が安定している。うまん性黒色腫は虹彩、毛様体、または甲状腺のメラノサイトから生じ、転移を発症すると非常に致死性の疾患である。うびろ黒色腫転移患者の死亡率は、転移の初期診断後2年で1年で80%、2年で92%であった。転移と死亡の診断の間の時間は、典型的には、治療3、4に関係なく、6ヶ月未満の短い。癌は血液を介して広がり、肝臓に支配的に転移する傾向がある(89-93%)4、5。肝転移性うveal黒色腫のさらなる調査には、効果的なマウスモデルが緊急に必要である。翻訳研究のために、肝局在性転移性うveanomaマウスモデルを生成する明確な需要がある。
患者由来腫瘍異種移植片(PDX)マウスモデルは、個別化医療戦略を提供することが期待される。これらのモデルは、臨床結果の予測であり得る、 前臨床薬物評価に有用であり、腫瘍6の生物学的研究に使用される。代表的なPDXモデルは、皮下部位に腫瘍を有する子宮外腫瘍移植異種移植マウスである。ほとんどの研究者は、特別な練習7、8なしで皮下移植のための手術を行うことができます。彼らはまた、皮下腫瘍を容易に監視することができます。皮下PDXモデルは研究段階で普及しましたが、実用化に向けていくつかのハードルがあります。皮下移植は、患者由来の腫瘍を腫瘍起源とは異なる微小環境で生着させ、生着障害および遅い腫瘍増殖9、10、11につながるようにする。 12、13、14.直交移植は、元の腫瘍15、16と同じ器官を使用するので、PDXモデルにとってより理想的で合理的なアプローチであり得る。
最近では、培養ヒト肝臓転移性ブドウ色黒色腫細胞株をNODで培養した患者由来肝転移性ブドウ色腫腫瘍の外科的オルトトピック移植技術と針注射技術のプロトコルを開発した。Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) マウス17,18.プロトコルは、一貫して高い技術的成功率をもたらす。また、内部肝腫瘍の検出に役立つCT走査技術を確立し、PDXプラットフォームで凍結保存腫瘍の再移植を開発しました。我々は、ウVEAL黒色腫腫瘍異種移植片モデルが、組織病理学的および分子的特徴を含む元の患者肝腫瘍の特徴を維持することを見出した。これらの技術は、翻訳研究における子宮頸黒色腫の肝直芽腫瘍モデルのためのより良いプラットフォームを提供する。
Protocol
研究に登録された患者は、機関審査委員会承認のプロトコルによると、研究目的および遺伝学的研究のために廃棄された外科サンプルの使用を可能にする書面による同意を提供すべきである。このプロトコルは、国立衛生研究所の実験動物のケアと使用のためのガイドの勧告に厳密に従って行われ、機関動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認されました。 1. 新鮮な患者…
Representative Results
肝臓ポケット法を用いた外科的オルトトピック移植は、ヒト肝臓転移性うveveal黒色腫腫瘍を6ヶ月以内に80%の高い成功率でマウス肝臓に移植することができる。異種移植片腫瘍は、娘結節のない孤独な腫瘍として肝臓に生着する(図1および図3A)。マイクロニードルを用いた肝臓への外科的オルトトピック注射技術は、全症例?…
Discussion
現在のオルソトピック異種移植モデルは、手間がかかり、時間がかかり、作成にコストがかかります。肝臓癌に対する直交性腫瘍異種移植片マウスモデルは、20年以上前に確立された19,20,21.しかし、この技術は複雑であり、マイクロニードルホルダーや6-0~8-0などの特殊な機器を使用する必要があります。顕微鏡の下の細か…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
原稿を見直してくれた大原M.、さぼり、寺井M.に感謝しています。著者らは、フォックスチェイスがんセンターのR.サト博士によるこの原稿の編集と英語の援助に対する批判的なレビューを認めている。本明細書に記載された研究は、ボニー・クロール研究基金、マーク・ワイナー研究基金、トーマス・ジェファーソン大学眼黒色腫研究基金、大阪コミュニティ財団、JSPS KAKENHI補助金番号JP 18K15596(大阪市)大学。A.アプリン博士の研究室での研究は、NIH助成金R01 GM067893によってサポートされました。このプロジェクトは、学部長の変革科学賞、トーマス・ジェファーソン大学プログラム・イニシアティブ賞によっても資金提供されました。
Materials
| Materials, tissues and animals | |||
| Buprenorphine | |||
| CO2 tank | |||
| Cryomedium | |||
| Exitron nano 12000 (Alkaline earth metal-based nanoparticle contrast agent) | Miltenyl Biotec | 130-095-700 | |
| HBSS 1X, with calcium & magnesium | Corning | 21-020-CM | |
| Human liver metastatic uveal melanoma cell line | |||
| Human uveal melanoma tissue in the liver | All tissue handling should be done in a Biosafety Level 2 hood. Be careful when working with human tissue; always use gloves and avoid direct skin contact. Assume patients may have been infected with HIV or other highly transmissible organisms. Do not process samples known to carry infections. | ||
| Iodine | |||
| Isoflurane | Purdue Products | 67618-150-17 | |
| Isopropanol | Fisher scientific | A416-1 | Avoid direct contact to skin and eye and inhalation of anesthetic agent. |
| Liquid nitrogen | |||
| Matrigel HC | BD | 354248 | |
| NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | Jackson Lab | 5557 | 4 to 8 weeks old |
| PBS 1X, without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CM | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-013-CV | |
| Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol) | Nice-Pak products | B603 | |
| 4% paraformaldehyde phosphate buffer solution | Wako | 163-20145 | |
| 70% Ethyl alcohol solution | Fisher Scientific | 04-355-122 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Absorbable hemostat | Johnson and Johnson | 63713-0019-61 | |
| Autoclave | |||
| Body weight measure | |||
| Cautery | Bovie Medical | MC-23009 | |
| Cell counter | |||
| Centrifuzer | |||
| Cotton swab | |||
| Cryo freezing container | NALGENE | 5100-0001 | |
| Cryotube | SARSTEDT | 72.379 | |
| Curved scissors | World Precision Instruments | 503247 | |
| Curved ultrafine forceps | World Precision Instruments | 501302 | |
| Fabric sheet | |||
| Freezer | |||
| F/AIR Filter Canister | Harvard Apparatus | 600979 | |
| Heating pad | |||
| Isoflurane vaporizer | Artisan Scientific | 66317-1 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Liquid nitrogen jar | Thermo Fisher Scientific | 2123 | |
| Micro-CT scan | Siemens | ||
| Needle holder | World Precision Instruments | 501246 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Pipette | |||
| Spray bottle | |||
| Sterile hood | Biosafety level 2 cabinet | ||
| Sterile No.11 scalpel | AD Surgical | A300-11-0 | |
| Straight forceps | World Precision Instruments | 14226 | |
| Surgical drape | |||
| Tail vein restrainer | Braintree Scientific | TV-150-STD | |
| Water bath | |||
| 1 ml TB syringe with 27-gauge needle | BD | 309623 | |
| 1.7 ml tube | Bioexpress | C-3260-1 | |
| 5-0 PDO Suture | AD Surgical | S-D518R13 | |
| 15 mL conical tubes | AZER SCIENTIFIC | ES-9152N | |
| 27-gauge needle | BD | 780301 | |
| 27-gauge needle | Hamilton | 7803-01 | |
| 50 mL conical tubes | AZER SCIENTIFIC | ES-9502N | |
| 50 µl micro syringe | BD | 80630 | |
| 50 µl micro syringe | Hamilton | 7655-01 | |
| 100 mL container | Fisher Scientific | 12594997 | |
| 200μl tip |
Riferimenti
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Citazione di questo articolo
Kageyama, K., Ozaki, S., Sato, T. Generation of a Liver Orthotopic Human Uveal Melanoma Xenograft Platform in Immunodeficient Mice. J. Vis. Exp. (153), e59941, doi:10.3791/59941 (2019).