Geração de uma plataforma de xenoenxerto de melanoma uveal humano ortotópico do fígado em camundongos imunodeficientes
Summary
Modelos ortotópicos de camundongos de melanoma uveal uveal uveal do fígado foram criados usando técnicas cirúrgicas de implantação ortotópica com esquema tumoral derivado do paciente e técnicas de injeção de agulha com linhas de células de melanoma uveal humana cultivadas.
Abstract
Nas últimas décadas, tumores xenoenxertos subcutâneos implantados no paciente ou linhas de células humanas cultivadas têm sido cada vez mais reconhecidos como modelos mais representativos para estudar cânceres humanos em camundongos imunodeficientes do que a célula humana estabelecida tradicional linhas in vitro. Recentemente, modelos de xenoenxerto tumoral derivados do paciente (PDX) ortotópicos implantados em camundongos foram desenvolvidos para melhor replicar características dos tumores de pacientes. Espera-se que um modelo de camundongo xenoenxerto ortotópico do fígado seja uma plataforma útil de pesquisa sobre o câncer, fornecendo insights sobre biologia tumoral e terapia medicamentosa. No entanto, a implantação do tumor ortotópico do fígado é geralmente complicada. Aqui descrevemos nossos protocolos para a implantação ortotópica de tumores uveal uveal metastáticos derivados do fígado. Nós cultamos linhas de células de melanoma uveal metastático do fígado humano em camundongos imunodeficientes. Os protocolos podem resultar em taxas de sucesso técnico consistentemente altas usando uma técnica de implantação ortotópica cirúrgica com pedaços de tumor de melanoma uveal derivado do paciente ou uma técnica de injeção de agulha com linha de células humanas cultivadas. Também descrevemos protocolos de tomografia computadorizada para detectar tumores hepáticos interiores e para técnicas de reimplantação usando tumores criopreservados para alcançar o reenxerto. Juntos, esses protocolos fornecem uma plataforma melhor para modelos de camundongos tumorais ortotópicos do fígado de melanoma uveal metastático do fígado em pesquisa translacional.
Introduction
O melanoma uveal é o tumor maligno intraocular mais comum entre adultos no mundo ocidental. Nos últimos 50 anos, a incidência de melanoma uveal (5,1 casos por milhão) manteve-se estável nos Estados Unidos1,2. O melanoma uveal surge de melanócitos na íris, corpo ciliário ou choroide, e é uma doença extremamente letal quando desenvolve metástase. A taxa de mortalidade de pacientes com metástase de melanoma uveal foi de 80% aos 1 ano e 92% aos 2 anos após o diagnóstico inicial das metástases. O tempo entre o diagnóstico de metástases e morte é tipicamente curto, menos de 6 meses, sem levar em conta a terapia3,4. O câncer se espalha através do sangue e tende a metástase dominante mente para o fígado (89-93%)4,5. Um modelo eficaz do rato é urgente necessário para uma investigação mais adicional da melanoma uveal fígado-metastática. Para a pesquisa translacional, há uma clara demanda para gerar um modelo de camundongo uveal metastático localizado no fígado.
Espera-se que os modelos de camundongos tumorais derivados do paciente forneçam estratégias de medicamentos individualizados. Estes modelos podem ser preditivos de desfechos clínicos, ser úteis para avaliação de medicamentos pré-clínicos e ser usados para estudos biológicos de tumores6. Os modelos representativos de PDX são camundongos xenoenxerto supada tumoralmente ectópica, que têm tumor em locais subcutâneos. A maioria dos pesquisadores pode fazer cirurgia para implantação subcutânea sem prática especial7,8. Eles também podem monitorar tumores subcutâneos facilmente. Embora os modelos PDX subcutâneos se tornaram populares na fase de pesquisa, eles têm alguns obstáculos na mudança para uso prático. Implantação subcutânea força tumores derivados do paciente a enxetorgravura em um microambiente diferente da origem tumoral, de modo que leva à falha do enxerto e ao crescimento lento do tumor 9,10,11, 12,13,14. O enxerto ortotópico pode ser uma abordagem mais ideal e racional para um modelo PDX porque usa o mesmo órgão que o tumor original15,16.
Recentemente, desenvolvemos protocolos para técnicas cirúrgicas de implantação ortotópica de tumores de melanoma uveal metastáticos do fígado derivados do paciente e técnicas de injeção de agulha com uma linha de células de melanoma uveal metastático do fígado humano cultivada no NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) ratos17,18. Os protocolos resultam em taxas de sucesso técnico consistentemente altas. Também estabelecemos técnicas de tomografia computadorizada que são úteis para detectar tumores hepáticos interiores, e desenvolvemos reimplantação de tumores criopreservados na plataforma PDX. Nós encontramos que os modelos uveal do xenograft do melanoma mantêm as características do tumor paciente original do fígado, incluindo suas características histopatológicas e moleculares. Juntas, essas técnicas fornecem uma plataforma melhor para modelos de tumorortópico hepático para melanoma uveal em pesquisatranscional.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os modelos ortotópicos atuais do xenograft são labor-intensive, demorados, e caros criar. Modelos de camundongos xenoenxerto de tumor ortotópico para câncer de fígado foram estabelecidos há mais de duas décadas há19,20,21. No entanto, esta técnica é complicada e requer o uso de equipamentos especiais, como um suporte de microagulha e 6-0 a 8-0 suturas finas um microscópio. Tumor e tecido hepático normal devem ser cos…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Somos gratos a M. Ohara, K. Saito e M. Terai, por revisaro manuscrito. Os autores reconhecem a revisão crítica para o auxílio editorial e inglês deste manuscrito pelo Dr. R. Sato no centro do cancer da perseguição da raposa. O trabalho aqui descrito foi apoiado pelo Bonnie Kroll Research Fund, o Mark Weinzierl Research Fund, o Eye Melanoma Research Fund da Thomas Jefferson University, the Osaka Community Foundation e JSPS KAKENHI Grant Number JP 18K15596 em Osaka City Universidade. Estudos no laboratório do Dr. A. Aplin foram apoiados pela concessão do NIH R01 GM067893. Este projeto também foi financiado pelo Prêmio de Ciência Transformadora do Reitor, um Prêmio de Iniciativa Programática da Universidade Thomas Jefferson.
Materials
| Materials, tissues and animals | |||
| Buprenorphine | |||
| CO2 tank | |||
| Cryomedium | |||
| Exitron nano 12000 (Alkaline earth metal-based nanoparticle contrast agent) | Miltenyl Biotec | 130-095-700 | |
| HBSS 1X, with calcium & magnesium | Corning | 21-020-CM | |
| Human liver metastatic uveal melanoma cell line | |||
| Human uveal melanoma tissue in the liver | All tissue handling should be done in a Biosafety Level 2 hood. Be careful when working with human tissue; always use gloves and avoid direct skin contact. Assume patients may have been infected with HIV or other highly transmissible organisms. Do not process samples known to carry infections. | ||
| Iodine | |||
| Isoflurane | Purdue Products | 67618-150-17 | |
| Isopropanol | Fisher scientific | A416-1 | Avoid direct contact to skin and eye and inhalation of anesthetic agent. |
| Liquid nitrogen | |||
| Matrigel HC | BD | 354248 | |
| NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | Jackson Lab | 5557 | 4 to 8 weeks old |
| PBS 1X, without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CM | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-013-CV | |
| Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol) | Nice-Pak products | B603 | |
| 4% paraformaldehyde phosphate buffer solution | Wako | 163-20145 | |
| 70% Ethyl alcohol solution | Fisher Scientific | 04-355-122 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Absorbable hemostat | Johnson and Johnson | 63713-0019-61 | |
| Autoclave | |||
| Body weight measure | |||
| Cautery | Bovie Medical | MC-23009 | |
| Cell counter | |||
| Centrifuzer | |||
| Cotton swab | |||
| Cryo freezing container | NALGENE | 5100-0001 | |
| Cryotube | SARSTEDT | 72.379 | |
| Curved scissors | World Precision Instruments | 503247 | |
| Curved ultrafine forceps | World Precision Instruments | 501302 | |
| Fabric sheet | |||
| Freezer | |||
| F/AIR Filter Canister | Harvard Apparatus | 600979 | |
| Heating pad | |||
| Isoflurane vaporizer | Artisan Scientific | 66317-1 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Liquid nitrogen jar | Thermo Fisher Scientific | 2123 | |
| Micro-CT scan | Siemens | ||
| Needle holder | World Precision Instruments | 501246 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Pipette | |||
| Spray bottle | |||
| Sterile hood | Biosafety level 2 cabinet | ||
| Sterile No.11 scalpel | AD Surgical | A300-11-0 | |
| Straight forceps | World Precision Instruments | 14226 | |
| Surgical drape | |||
| Tail vein restrainer | Braintree Scientific | TV-150-STD | |
| Water bath | |||
| 1 ml TB syringe with 27-gauge needle | BD | 309623 | |
| 1.7 ml tube | Bioexpress | C-3260-1 | |
| 5-0 PDO Suture | AD Surgical | S-D518R13 | |
| 15 mL conical tubes | AZER SCIENTIFIC | ES-9152N | |
| 27-gauge needle | BD | 780301 | |
| 27-gauge needle | Hamilton | 7803-01 | |
| 50 mL conical tubes | AZER SCIENTIFIC | ES-9502N | |
| 50 µl micro syringe | BD | 80630 | |
| 50 µl micro syringe | Hamilton | 7655-01 | |
| 100 mL container | Fisher Scientific | 12594997 | |
| 200μl tip |
Riferimenti
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