Adattamento semi-alto/throughput del saggio ATPase accoppiato NADH per lo screening degli inibitori delle piccole molecole
Summary
Un saggio ATPase accoppiato a nicotinamide (NADH) è stato adattato allo screening semi-alto flusso di inibitori della miosina. Questo saggio cinetico viene eseguito in un formato a microplacca 384 pozzetti con volumi di reazione totali di soli 20 l per pozzo. La piattaforma dovrebbe essere applicabile praticamente a qualsiasi enzima che produce ADP.
Abstract
Gli enzimi ATPase utilizzano l’energia libera immagazzinata nel triposfato adenosina per catalizzare un’ampia varietà di processi biochimici endergonici in vivo che non si verificherebbero spontaneamente. Queste proteine sono fondamentali per essenzialmente tutti gli aspetti della vita cellulare, tra cui il metabolismo, la divisione cellulare, le risposte ai cambiamenti ambientali e il movimento. Il protocollo qui presentato descrive un saggio ATPase accoppiato a nicotinamide (NADH) che è stato adattato allo screening semi-alto della produttività degli inibitori ATPase a piccole molecole. Il saggio è stato applicato alla miosina cardiaca e scheletrica di miosina II, due ATPases motori molecolari basati su actin, come prova di principio. L’idrolisi dell’ATP è accoppiata all’ossidazione di NADH da reazioni enzimatiche nel saggio. In primo luogo, l’ADP generato dall’ATPase viene rigenerato in ATP dalla chinasi pirativae (PK). PK catalizza la transizione del fosforolpyruvate (PEP) alla pirofavia in parallelo. Successivamente, il pirate viene ridotto al lattato mediante dehydrogenase di lattato (LDH), che catalizza l’ossidazione di NADH in parallelo. Pertanto, la diminuzione della concentrazione di ATP è direttamente correlata alla diminuzione della concentrazione di NADH, seguita da un cambiamento alla fluorescenza intrinseca di NADH. Finché la PEP è disponibile nel sistema di reazione, la concentrazione di ADP rimane molto bassa, evitando l’inibizione dell’enzima ATPase da parte del proprio prodotto. Inoltre, la concentrazione ATP rimane quasi costante, producendo corsi temporali lineari. La fluorescenza viene monitorata continuamente, il che consente una facile stima della qualità dei dati e aiuta a filtrare i potenziali artefatti (ad esempio, derivanti da precipitazioni composte o cambiamenti termici).
Introduction
I miosini sono trasduttori di energia meccanochimica che idrolizzano il tripfosfato di adenosina (ATP) per generare movimento direzionale lungo i filamenti del citoscheletro actinos in eucarioti1,2. Si sono adattati sia strutturalmente che kineticamente alle loro varie funzioni intracellulari, come il trasporto di organelli, la contrazione muscolare o la generazione di tensione citoscheletrica1,2. La superfamiglia della miosina è rappresentata da 40 geni della miosina appartenenti a classi di miosina distinte da 12 dollari nel genoma umano3,4. I membri delle classi di miosina svolgono vari ruoli in una serie molto diversificata di disturbi, come diversi tumori, disturbi neurologici, miopatie scheletriche e cardiomiopatia ipertrofica5,6. Dato il gran numero di funzioni fisiologiche e patologiche di questi motori molecolari, non è sorprendente che stiano diventando sempre più riconosciuti come bersagli farmacologici per una varietà di condizioni7. Recentemente sono stati compiuti progressi significativi nella scoperta di nuovi inibitori della miosina8,9,10 e attivatori11, e per migliorare le proprietà di quelli esistenti12, 13 del sistema , 14 Del sistema , 15.
Il saggio ATPase (NADH) accoppiato alla nicotinammide adenina (NADH) è stato a lungo utilizzato per misurare l’attività ATPase di vari enzimi, come il reticulum sarccoplasmico Ca2o pompa ATPase16, la riparazione del DNA ATPase Rad5417, l’AAA ATPase p9718 o il motore microtubulo kinesin19. Il saggio utilizza un ciclo di rigenerazione ATP. Il difosfato di adenosina (ADP) generato dall’ATPase viene rigenerato all’ATP dalla chinasi pirata (PK), che trasforma una molecola di fosforenolpyruvate (PEP) in pyruvate in parallelo. Successivamente, il pirate viene ridotto al lattato dalla dehydrogenasi lattato (LDH). Che, a sua volta, ossida una molecola di NADH a NAD. Pertanto, la diminuzione della concentrazione di NADH in funzione del tempo è uguale al tasso di idrolisi ATP. Il ciclo di rigenerazione ATP mantiene la concentrazione ATP quasi costante e la concentrazione di ADP bassa fino a quando è disponibile PEP. Questo si traduce in corsi di tempo lineari, rendendo semplice determinare i tassi di reazione iniziali e aiuta a evitare l’inibizione del prodotto da ADP19. Anche se il test ATPase accoppiato con NADH è già stato adattato ad un formatoa96 ben20, gli elevati volumi di reazione (150 dollari) lo rendono relativamente costoso a causa dell’elevata domanda di reagenti, rendendolo meno suscettibile di screening rapido di un gran numero di Composti. I metodi alternativi, come il test verde malessere19,21, che si basa sulla rilevazione del fosfato prodotto dall’enzima ATPase, si sono dimostrati più adatti per la miniaturizzazione e lo screening ad alto valore22 , 23 del 23 o , 24.Tuttavia, è più probabile che un’espressione endpoint sia influenzata da diversi artefatti (discussi di seguito), che potrebbero rimanere sconosciuti in assenza di corsi a tempo pieno.
In questo caso, il saggio ATPase accoppiato nADH è stato ottimizzato per lo screening semi-alto della produttività degli inibitori delle piccole molecole. La miosina scheletrica e cardiaca muscolare miosina II e gli inibitori della miosina blebbistatin8, para-aminoblebbistatin13 e para-nitroblebbistatin12 sono utilizzati per dimostrare la potenza del saggio, che si basa su NADH fluorescenza come una lettura. Questo protocollo è suscettibile di vagliare progetti incentrati su qualsiasi enzimi che producono ADP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Passaggi critici nel protocollo
Ottimizzare il layout della piastra eseguendo più piastre con controllo negativo (reazione ATPase senza inibitore). Esaminare attentamente i risultati per i modelli nei tassi di reazione. Ad esempio, questi possono derivare da effetti di bordo e/o imperfezioni nel rivestimento superficiale idrofilo di piastre “non vincolanti”. Se si osserva un motivo, modificare il tipo di piastra e/o il layout della lastra per ridurre al minimo gli artefatti. …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione dell’Istituto Nazionale di Disturbi Neurologici e Ictus e Istituto Nazionale per l’abuso di droga NS096833 (CAM).
Materials
| 384-well Low Flange Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate | Corning | 3575 | |
| ATP (Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate) | Sigma | A7699 | |
| Aurora FRD-IB Dispenser | Aurora Discovery, Inc. | 00017425 | |
| Biomek NXP Multichannel Laboratory Automation Workstation | Beckman Coulter | A31841 | |
| Blebbistatin | AMRI | N/A | Custom synthesis |
| BSA (Bovine Serum Albumin, Protease-Free) | Akron Biotech | AK1391 | |
| Centrifuge 5430 R, refrigerated, with Rotor FA-35-6-30 | Eppendorf | 022620663 | |
| Centrifuge 5430, non-refrigerated, with Rotor A-2-MTP | Eppendorf | 022620568 | |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma | D2650 | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | Sigma | D5545 | |
| E1 ClipTip Multichannel Pipette; 384-format; 8-channel | Thermo Scientific | 4672010 | |
| E1 ClipTip Multichannel Pipette; 96-format; 8-channel | Thermo Scientific | 4672080 | |
| EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid) | Sigma | E3889 | |
| EnVision 2104 Multilabel Plate Reader | PerkinElmer | 2104-0010 | |
| Glycerol | Sigma | G2025 | |
| LDH (L-Lactic Dehydrogenase from rabbit muscle) | Sigma | L1254 | |
| MgCl2.6H2O (Magnesium chloride hexahydrate) | Sigma | M2670 | |
| Microplate Shaker | VWR | 12620-926 | |
| Microplate, 384 well, PP, Small Volume, Deep Well, Natural | Greiner Bio-One | 784201 | |
| MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid) | Sigma | M1254 | |
| Myosin Motor Protein (full length) (Bovine cardiac muscle) | Cytoskeleton | MY03 | |
| Myosin Motor Protein (full length) (Rabbit skeletal muscle) | Cytoskeleton | MY02 | |
| NADH (β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate) | Sigma | N8129 | |
| NaN3 (Sodium azide) | Sigma | 71289 | |
| NaOH (Sodium hydroxide) | Sigma | S8045 | |
| Optical Filter CFP 470/24nm (Emission) | PerkinElmer | 2100-5850 | Barcode 240 |
| Optical Filter Fura2 380/10nm (Excitation) | PerkinElmer | 2100-5390 | Barcode 112 |
| Optical Module: Beta Lactamase | PerkinElmer | 2100-4270 | Barcode 418 |
| OriginPro 2017 software | OriginLab | N/A | |
| para-Aminoblebbistatin | AMRI | N/A | Custom synthesis |
| para-Nitroblebbistatin | AMRI | N/A | Custom synthesis |
| PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monopotassium salt) | Sigma | P7127 | |
| PK (Pyruvate Kinase from rabbit muscle) | Sigma | P9136 | |
| Rabbit Muscle Acetone Powder | Pel Freez Biologicals | 41995-2 |
Riferimenti
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