Uma adaptação semi-high-throughput do ensaio ATPase NADH-acoplado para a seleção de inibidores pequenos da molécula
Summary
Um ensaio de ATPase acoplado a nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADH) foi adaptado à triagem de taxa de transferência semialta de inibidores de miosina de pequena molécula. Este ensaio cinético é executado em um formato de microplaca de 384 poços com volumes de reação total de apenas 20 μL por poço. A plataforma deve ser aplicável a praticamente qualquer enzima produtora de ADP.
Abstract
As enzimas ATPase utilizam a energia livre armazenada em trifosfato de adenosina para catalisar uma grande variedade de processos bioquímicos endergônicos in vivo que não ocorreriam espontaneamente. Estas proteínas são cruciais para essencialmente todos os aspectos da vida celular, incluindo o metabolismo, divisão celular, respostas a mudanças ambientais e movimento. O protocolo aqui apresentado descreve um ensaio de ATPase acoplado a nicotinamida adenina dinucleotídeo que foi adaptado à triagem de taxa de transferência semialta de inibidores de ATPase de pequenas moléculas. O ensaio foi aplicado à miosina II do músculo cardíaco e esquelético, dois ATPases motores moleculares à base de actina, como prova de princípio. A hidrólise do ATP é acoplada à oxidação de NADH por reações enzimáticas no ensaio. Primeiramente, o ADP gerado pelo ATPase é regenerado ao ATP pelo piruvato kinase (PK). PK catalisa a transição de fosfoenolpiruvato (PEP) para piruvato em paralelo. Subseqüentemente, o piruvato é reduzido ao lactato pelo desidrogenase do lactato (LDH), que catalisa a oxidação de NADH paralelamente. Assim, a diminuição da concentração de ATP está diretamente correlacionada com a diminuição da concentração de NADH, que se segue da mudança para a fluorescência intrínseca da NADH. Contanto que o PEP esteja disponível no sistema de reação, a concentração de ADP permanece muito baixa, evitando a inibição da enzima ATPase pelo seu próprio produto. Além disso, a concentração de ATP permanece quase constante, produzindo cursos de tempo linear. A fluorescência é monitorada continuamente, o que permite uma fácil estimativa da qualidade dos dados e ajuda a filtrar artefatos potenciais (por exemplo, decorrentes de precipitação composta ou alterações térmicas).
Introduction
Myosins são transdutores de energia Mecanoquímica que hidrolisam trifosfato de adenosina (ATP) para gerar movimento direcional ao longo dos filamentos do citoesqueleto de actina em eucariontes1,2. Eles têm tanto estruturalmente e kineticamente adaptados às suas várias funções intracelulares, como o transporte de organelas, contração muscular ou a geração de tensão citoesquelética1,2. A superfamília da miosina é representada por ~ 40 genes de miosina pertencentes a ~ 12 classes distintas de miosina no genoma humano3,4. Os membros das classes de miosina desempenham vários papéis em um conjunto altamente diversificado de distúrbios, como vários cânceres, distúrbios neurológicos, miopatias esqueléticas e cardiomiopatia hipertrófica5,6. Dado o grande número de funções fisiológicas e patológicas destes motores moleculares, não é surpreendente que eles estão se tornando cada vez mais reconhecidos como alvos de drogas para uma variedade de condições7. Avanços significativos foram feitos recentemente na descoberta de novos inibidores da miosina8,9,10 e ativadores11, e para melhorar as propriedades dos já existentes12, 13 anos de , 14 anos de , quinze anos.
A nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADH)-acoplado ATPase ensaio tem sido usado para medir a atividade ATPase de várias enzimas, tais como o retículo sarcoplasmático CA2 + bomba ATPase16, o reparo de DNA ATPase RAD5417, o AAA + ATPase p9718 ou o motor microtúnica cinesina19. O ensaio emprega um ciclo de regeneração ATP. O difosfato de adenosina (ADP) gerado pela ATPase é regenerado para ATP por piruvato quinase (PK), que transforma uma molécula de fosfoenolpiruvato (PEP) em piruvato em paralelo. Subseqüentemente, o piruvato é reduzido ao lactato pelo desidrogenase do lactato (LDH). Isso, por sua vez, oxida uma molécula de NADH a NAD. Portanto, a diminuição da concentração de NADH em função do tempo é igual à taxa de hidrólise do ATP. O ciclo de regeneração ATP mantém a concentração de ATP quase constante e a concentração de ADP baixa, contanto que PEP esteja disponível. Isso resulta em cursos de tempo linear, tornando simples determinar as taxas de reação inicial e ajuda a evitar a inibição do produto pela ADP19. Embora o ensaio ATPase acoplado ao NADH já tenha sido adaptado a um formato 96-bem20, os volumes de alta reação (~ 150 μL) tornam-se relativamente dispendiosos devido à alta demanda de reagentes, tornando-o menos adequado à rápida triagem de um grande número de Compostos. Métodos alternativos, como o ensaio verde de Malaquita19,21, que depende da detecção do fosfato produzido pela enzima ATPase, foram comprovados mais adequados para miniaturização e triagem de alta produtividade22 , 23 anos de , 24. no entanto, um ensaio de ponto final é mais susceptível de ser afectado por vários artefactos (discutidos abaixo), que podem continuar a não ser descobertos na ausência de cursos a tempo inteiro.
Aqui, o ensaio ATPase acoplado à NADH foi otimizado para triagem de produção semialta de inibidores de pequenas moléculas. O músculo esquelético e cardíaco miosina II e os inibidores da miosina blebbistatina8 , para-aminoblebbistatin13 e para-nitroblebbistatin12 são utilizados para demonstrar o poder do ensaio, que se baseia na NADH fluorescência como uma leitura. Este protocolo é capaz de triagem de projetos focados em qualquer ADP produzindo enzimas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Etapas críticas no protocolo
Otimize o layout da placa executando várias placas com controle negativo somente (reação de ATPase sem inibidor). Inspecione os resultados cuidadosamente para padrões em taxas de reação. Por exemplo, estes podem surgir de efeitos de aresta e/ou imperfeições no revestimento de superfície hidrófilo de placas “não vinculantes”. Se um padrão for observado, mude o tipo de chapa e/ou o layout da placa para minimizar os artefatos. Por exemplo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por uma subvenção do Instituto Nacional de distúrbios neurológicos e AVC e Instituto Nacional de abuso de drogas NS096833 (CAM).
Materials
| 384-well Low Flange Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate | Corning | 3575 | |
| ATP (Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate) | Sigma | A7699 | |
| Aurora FRD-IB Dispenser | Aurora Discovery, Inc. | 00017425 | |
| Biomek NXP Multichannel Laboratory Automation Workstation | Beckman Coulter | A31841 | |
| Blebbistatin | AMRI | N/A | Custom synthesis |
| BSA (Bovine Serum Albumin, Protease-Free) | Akron Biotech | AK1391 | |
| Centrifuge 5430 R, refrigerated, with Rotor FA-35-6-30 | Eppendorf | 022620663 | |
| Centrifuge 5430, non-refrigerated, with Rotor A-2-MTP | Eppendorf | 022620568 | |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma | D2650 | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | Sigma | D5545 | |
| E1 ClipTip Multichannel Pipette; 384-format; 8-channel | Thermo Scientific | 4672010 | |
| E1 ClipTip Multichannel Pipette; 96-format; 8-channel | Thermo Scientific | 4672080 | |
| EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid) | Sigma | E3889 | |
| EnVision 2104 Multilabel Plate Reader | PerkinElmer | 2104-0010 | |
| Glycerol | Sigma | G2025 | |
| LDH (L-Lactic Dehydrogenase from rabbit muscle) | Sigma | L1254 | |
| MgCl2.6H2O (Magnesium chloride hexahydrate) | Sigma | M2670 | |
| Microplate Shaker | VWR | 12620-926 | |
| Microplate, 384 well, PP, Small Volume, Deep Well, Natural | Greiner Bio-One | 784201 | |
| MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid) | Sigma | M1254 | |
| Myosin Motor Protein (full length) (Bovine cardiac muscle) | Cytoskeleton | MY03 | |
| Myosin Motor Protein (full length) (Rabbit skeletal muscle) | Cytoskeleton | MY02 | |
| NADH (β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate) | Sigma | N8129 | |
| NaN3 (Sodium azide) | Sigma | 71289 | |
| NaOH (Sodium hydroxide) | Sigma | S8045 | |
| Optical Filter CFP 470/24nm (Emission) | PerkinElmer | 2100-5850 | Barcode 240 |
| Optical Filter Fura2 380/10nm (Excitation) | PerkinElmer | 2100-5390 | Barcode 112 |
| Optical Module: Beta Lactamase | PerkinElmer | 2100-4270 | Barcode 418 |
| OriginPro 2017 software | OriginLab | N/A | |
| para-Aminoblebbistatin | AMRI | N/A | Custom synthesis |
| para-Nitroblebbistatin | AMRI | N/A | Custom synthesis |
| PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monopotassium salt) | Sigma | P7127 | |
| PK (Pyruvate Kinase from rabbit muscle) | Sigma | P9136 | |
| Rabbit Muscle Acetone Powder | Pel Freez Biologicals | 41995-2 |
Riferimenti
- Heissler, S. M., Sellers, J. R. Kinetic Adaptations of Myosins for Their Diverse Cellular Functions. Traffic. 17 (8), 839-859 (2016).
- Hartman, M. A., Spudich, J. A. The myosin superfamily at a glance. Journal of Cell Science. 125 (Pt 7), 1627-1632 (2012).
- Berg, J. S., Powell, B. C., Cheney, R. E. A millennial myosin census. Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 780-794 (2001).
- Sebe-Pedros, A., Grau-Bove, X., Richards, T. A., Ruiz-Trillo, I. Evolution and classification of myosins, a paneukaryotic whole-genome approach. Genome Biology and Evolution. 6 (2), 290-305 (2014).
- Newell-Litwa, K. A., Horwitz, R., Lamers, M. L. Non-muscle myosin II in disease: mechanisms and therapeutic opportunities. Disease Models & Mechanisms. 8 (12), 1495-1515 (2015).
- He, Y. M., Gu, M. M. Research progress of myosin heavy chain genes in human genetic diseases. Yi Chuan. 39 (10), 877-887 (2017).
- Rauscher, A. A., Gyimesi, M., Kovacs, M., Malnasi-Csizmadia, A. Targeting Myosin by Blebbistatin Derivatives: Optimization and Pharmacological Potential. Trends in Biochemical Sciences. 43 (9), 700-713 (2018).
- Straight, A. F., et al. Dissecting temporal and spatial control of cytokinesis with a myosin II Inhibitor. Science. 299 (5613), 1743-1747 (2003).
- Sirigu, S., et al. Highly selective inhibition of myosin motors provides the basis of potential therapeutic application. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (47), E7448-E7455 (2016).
- Green, E. M., et al. A small-molecule inhibitor of sarcomere contractility suppresses hypertrophic cardiomyopathy in mice. Science. 351 (6273), 617-621 (2016).
- Morgan, B. P., et al. Discovery of omecamtiv mecarbil the first, selective, small molecule activator of cardiac Myosin. ACS Medicinal Chemistry Letters. 1 (9), 472-477 (2010).
- Kepiro, M., et al. para-Nitroblebbistatin, the non-cytotoxic and photostable myosin II inhibitor. Angewandte Chemie International Edition. 53 (31), 8211-8215 (2014).
- Varkuti, B. H., et al. A highly soluble, non-phototoxic, non-fluorescent blebbistatin derivative. Scientific Reports. 6, 26141 (2016).
- Verhasselt, S., et al. Discovery of (S)-3′-hydroxyblebbistatin and (S)-3′-aminoblebbistatin: polar myosin II inhibitors with superior research tool properties. Organic and Biomolecular Chemistry. 15 (9), 2104-2118 (2017).
- Verhasselt, S., Roman, B. I., Bracke, M. E., Stevens, C. V. Improved synthesis and comparative analysis of the tool properties of new and existing D-ring modified (S)-blebbistatin analogs. European Journal of Medicinal Chemistry. 136, 85-103 (2017).
- Warren, G. B., Toon, P. A., Birdsall, N. J., Lee, A. G., Metcalfe, J. C. Reconstitution of a calcium pump using defined membrane components. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (3), 622-626 (1974).
- Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. Rad54 protein exerts diverse modes of ATPase activity on duplex DNA partially and fully covered with Rad51 protein. Journal of Biological Chemistry. 277 (48), 46205-46215 (2002).
- Hanzelmann, P., Schindelin, H. Structural Basis of ATP Hydrolysis and Intersubunit Signaling in the AAA+ ATPase p97. Structure. 24 (1), 127-139 (2016).
- Hackney, D. D., Jiang, W. Assays for kinesin microtubule-stimulated ATPase activity. Methods in Molecular Biology. 164, 65-71 (2001).
- Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. NADH-coupled microplate photometric assay for kinetic studies of ATP-hydrolyzing enzymes with low and high specific activities. Analytical Biochemistry. 321 (2), 266-271 (2003).
- Carter, S. G., Karl, D. W. Inorganic phosphate assay with malachite green: an improvement and evaluation. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 7 (1), 7-13 (1982).
- Henkel, R. D., VandeBerg, J. L., Walsh, R. A. A microassay for ATPase. Analytical Biochemistry. 169 (2), 312-318 (1988).
- Rowlands, M. G., et al. High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity. Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).
- Rule, C. S., Patrick, M., Sandkvist, M. Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization. Journal of Visualized Experiments. (114), 54305 (2016).
- Pardee, J. D., Spudich, J. A. Purification of muscle actin. Methods in Cell Biology. 24, 271-289 (1982).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Kovacs, M., Toth, J., Hetenyi, C., Malnasi-Csizmadia, A., Sellers, J. R. Mechanism of blebbistatin inhibition of myosin II. Chem Journal of Biological Chemistry. 279 (34), 35557-35563 (2004).
- Allingham, J. S., Smith, R., Rayment, I. The structural basis of blebbistatin inhibition and specificity for myosin II. Nature Structural & Molecular Biology. 12 (4), 378-379 (2005).
- Kettlun, A. M., et al. Purification and Characterization of 2 Isoapyrases from Solanum-Tuberosum Var Ultimus. Phytochemistry. 31 (11), 3691-3696 (1992).
- Hulme, E. C., Trevethick, M. A. Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation. British Journal of Pharmacology. 161 (6), 1219-1237 (2010).
- Motulsky, H. J., Neubig, R. R. Analyzing binding data. Current Protocols in Neuroscience. 52 (1), 7.5.1-7.5.65 (2010).
- Sehgal, P., Olesen, C., Moller, J. V. ATPase Activity Measurements by an Enzyme-Coupled Spectrophotometric Assay. Methods in Molecular Biology. 1377, 105-109 (2016).
- Solinger, J. A., Lutz, G., Sugiyama, T., Kowalczykowski, S. C., Heyer, W. D. Rad54 protein stimulates heteroduplex DNA formation in the synaptic phase of DNA strand exchange via specific interactions with the presynaptic Rad51 nucleoprotein filament. Journal of Molecular Biology. 307 (5), 1207-1221 (2001).
- Banik, U., Roy, S. A continuous fluorimetric assay for ATPase activity. Biochemistry Journal. 266 (2), 611-614 (1990).
- Xiao, Y. X., Yang, W. X. KIFC1: a promising chemotherapy target for cancer treatment?. Oncotarget. 7 (30), 48656-48670 (2016).
- See, S. K., et al. Cytoplasmic Dynein Antagonists with Improved Potency and Isoform Selectivity. ACS Chemical Biology. 11 (1), 53-60 (2016).
- Datta, A., Brosh, R. M. New Insights Into DNA Helicases as Druggable Targets for Cancer Therapy. Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 59 (2018).
