Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Het verkrijgen van kanker stamcelbollen van gynaecologische en borstkankertumoren

Published: March 1, 2020 doi: 10.3791/60022
Automatic Translation
*1,2,3,4, *1,2,3,4,5,6, 1,2,3, 2,7, 1,2,3,4,8, 9, 3,9,10, 1,2,3,4,8
1Institute of Biophysics, Faculty of Medicine, University of Coimbra, 2Coimbra Institute for Clinical and Biomedical Research (iCBR), area of Environment Genetics and Oncobiology (CIMAGO), Faculty of Medicine, University of Coimbra, 3CNC.IBILI/Center for Innovative Biomedicine and Biotechnology (CIBB), University of Coimbra, 4Clinical Academic Center of Coimbra (CACC), 5Universitary Clinic of Gynecology, Faculty of Medicine, University of Coimbra, 6Gynecology A Service, Coimbra Hospital and Universitary Center, 7Institute of Pharmacology & Experimental Therapeutics, Faculty of Medicine, University of Coimbra, 8Institute of Experimental Pathology, Faculty of Medicine, University of Coimbra, 9Cytometry Operational Management Unit, Clinical Pathology Service, Coimbra Hospital and Universitary Center, 10Polytechnic Institute of Coimbra, ESTESC-Coimbra Health School, Laboratory Biomedical Sciences
* These authors contributed equally

Summary

Het doel van deze methodologie is om kankercellen (CSC) te identificeren in kankercellijnen en primaire menselijke tumormonsters met het bolvormende protocol, op een robuuste manier, met behulp van functionele testen en fenotypische karakterisering met stroomcytometrie en westerse Vlek.

Abstract

Kankercellen (CSC) zijn een kleine populatie met zelfvernieuwing en plasticiteit die verantwoordelijk zijn voor tumorigenese, resistentie tegen behandeling en terugkerende ziekte. Deze populatie kan worden geïdentificeerd door oppervlaktemarkers, enzymatische activiteit en een functioneel profiel. Deze benaderingen per se zijn beperkt, als gevolg van fenotypische heterogeniteit en CSC plasticiteit. Hier werken we het bolvormende protocol bij om CSC-bollen te verkrijgen van borst- en gynaecologische kankers, waarbij functionele eigenschappen, CSC-markers en eiwitexpressie worden beoordeeld. De bollen worden verkregen met eencellige zaaien bij lage dichtheid in de suspensiecultuur, met behulp van een halfvast methylcellulosemedium om migratie en aggregaten te voorkomen. Dit winstgevende protocol kan worden gebruikt in kankercellen, maar ook in primaire tumoren. De driedimensionale niet-aanhangende suspensie cultuur dacht aan de tumor micro-omgeving na te bootsen, met name de CSC-niche, wordt aangevuld met epidermale groeifactor en fundamentele fibroblast groeifactor om CSC signalering te waarborgen. Met het oog op een robuuste identificatie van CSC stellen we een complementaire aanpak voor, waarbij functionele en fenotypische evaluatie wordt gecombineerd. Gebiedsvormend vermogen, zelfvernieuwing en sfeerprojectiegebied vestigen csc-functionele eigenschappen. Daarnaast omvat karakterisering de evaluatie van de stroomcytometrie van de markers, vertegenwoordigd door CD44+/CD24- en CD133, en Western blot, gezien ALDH. Het gepresenteerde protocol werd ook geoptimaliseerd voor primaire tumormonsters, na een steekproefverteringsprocedure, nuttig voor translationeel onderzoek.

Introduction

De bevolking van kanker is heterogeen, met cellen die verschillende morfologieën, proliferatie en invasiecapaciteit, toe te schrijven aan differentiële genuitdrukking voorstellen. Onder deze cellen bestaat een minderheidspopulatie genaamd kankercellen (CSC)1, die de capaciteit hebben voor zelfvernieuwing, het recapituleren van de heterogeniteit van de primaire tumorniche en het produceren van afwijkend differentiërende voorlopers die niet adequaat reageren op homeostatische controles2. CSC-eigenschappen kunnen direct worden vertaald in de klinische praktijk, gezien de associatie met gebeurtenissen, zoals tumorigeniciteit of resistentie tegen chemotherapie3. De identificatie van CSC kan leiden tot de ontwikkeling van gerichte therapieën die blokkade van oppervlaktemarkeringen, bevordering van CSC-differentiatie, blokkering van CSC-signaleringspadcomponenten, nichevernietiging en epigenetische mechanismen4kunnen omvatten.

De isolatie van CSC is uitgevoerd in cellenlijnen en in monsters van primaire tumoren5,6,7,8. Het functionele profiel beschreven voor CSC omvat clonogene capaciteit, zijbevolking en tumorosfeer vorming9. De CD44hoge/ CD24lage fenotype is consequent geassocieerd met borst CSC, die heeft bewezen tumorigeen in vivo en is al geassocieerd met epitheel aan mesenchymale overgang5,10. Hoge ALDH activiteit is ook geassocieerd met stamness en epitheel aan mesenchymale overgang (EMT) in verschillende soorten vaste tumoren11. ALDH-expressie is geassocieerd met resistentie tegen chemotherapie en csc fenotype in vitro12,13,14,15,16. Verschillende andere markers zijn gekoppeld aan CSC-eigenschappen in verschillende soorten tumoren, zoals CD133, CD49f, ITGA6, CD1663,4 en anderen, zoals beschreven in tabel 1.

De tumorsferen bestaan uit een driedimensionaal model voor de studie en uitbreiding van CSC. In dit model worden de celsuspensen van cellijnen en van bloed- of tumormonsters gekweekt in een medium aangevuld met groeifactoren, namelijk epidermale groeifactor (EFG) en basisfibroblastgroeifactor (bFGF), zonder foetaal runderserum en in niet-aanhangende omstandigheden17. Remming van celhechting resulteert in de dood door anoikis van gedifferentieerde cellen18. Bollen zijn afgeleid van de kloongroei van een geïsoleerde cel. Hiertoe worden de cellen bij een lage dichtheid verdeeld om celfusie en aggregatie te voorkomen19. Een andere strategie omvat het gebruik van halfvaste methylcellulose20.

Het gebied-vormende protocol won populariteit in CSC isolatie en uitbreiding, als gevolg van tijd en kosten en technische, winstgevende, en reproduceerbare redenen21,22. Ondanks enkele reserves over de mate waarvan de bolvorming CSC weerspiegelt, is er een neiging van stamcellen om te groeien in niet-aanhangende omstandigheden met het karakteristieke fenotype, dat lijkt op de inheemse micro-omgeving21. Geen van de methoden die beschikbaar zijn voor isolatie van CSC van vaste tumoren heeft volledige efficiëntie, met de nadruk op het belang van het ontwikkelen van meer specifieke markers of combinaties van methodologieën en markers.

In dit protocol beschrijven we de isolatie van CSC met het gebiedsvormende protocol, met het principe van eencellige groei in niet-aanhangende omstandigheden en het vermogen om een gedifferentieerd fenotype te produceren. Een schematische weergave van deze procedure is vertegenwoordigd in figuur 1. We beschrijven ook de karakterisering met oppervlaktemarkers en ALDH-expressie voor CSC, zowel voor borst- als gynaecologische tumorcellenlijnen en monsters van primaire tumoren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dit protocol werd uitgevoerd in overeenstemming met de ethische richtlijnen van het Coimbra Hospital and Universitary Center (CHUC) Tumor Bank, en werd goedgekeurd door chuc's Ethics Committee for Health en door de Portugese National Data Protection Commission.

1. Sfeervormingprotocol en afgeleide aanhangende populaties uit continue celculturen

OPMERKING: Voer alle procedures uit onder strikte steriele omstandigheden.

  1. Bereiding van niet-aanhangende suspensiekweekkolven of -platen door het groeioppervlak te coaten met poly(2-hydroxyethyl-methacrylaat (poly-HEMA)
    1. Bereid een 15 mg/mL oplossing door poly-HEMA roeren in absolute ethanol bij 65 °C. Coat celkweekkolven of platen met 50 μL/cm2.
    2. Laat drogen bij 37 °C in een droogoven. Pak indien nodig de platen in en bewaar op kamertemperatuur.
  2. Voorbereiding van de sfeer kweekmedia (SCM)
    1. Bereid een 2% oplossing van methylcellulose in ultrazuiver water en steriliseren in het autoclave. Methylcellulose heeft de neiging om gemakkelijker te oplosbaar door koeling; strooi het poeder daarom in water bij 80 °C en roer tot gekoeld23.
    2. Bereid een tweekeer geconcentreerde oplossing van SCM (stock oplossing). SCM werkoplossing bevat DMEM-F12, aangevuld met 100 mM putrescine, 1% insuline, transferrin, selenium en 1% antibiotica-antimycotische oplossing (10.000 U/mL penicilline, 10 mg/mL streptomycine en 25 μg/mL amphotericine B).
    3. Meng gelijke volumes van de SCM-voorraadoplossing om de SCM-voorraadoplossing voor te bereiden met de 2%-oplossing van methylcellulose.
    4. Vul het medium onmiddellijk voor gebruik in door 10 ng/mL epidermale groeifactor (EFG) en 10 ng/mL basisfibroblastgroeifactor (bFGF) toe te voegen.
    5. Als er meer veeleisende cellijnen in gebruik zijn, vult u het medium aan met 0,4% runderserumalbumine, wat een voordeel zou kunnen zijn.
  3. Begin met een fles MCF7 of HCC1806 borstkanker of ECC-1 of RL95-2 endometrium kankercellen (of andere kankercel lijn van keuze) met 80% tot 90% samenvloeiing.
  4. Gooi de celkweekmedia weg, was met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en maak de cellen los met trypsin-EDTA (1 tot 2 mL voor een 75 cm2 celkweekkolf).
  5. Voeg celkweekmedia (2 tot 4 mL voor eenkolf van 75 cm 2 cellen) en centrifugeer bij 200 x g voor 5 min om enzymen af te doen.
  6. Hang de pellet op in een bekend volume van celkweekmedia en pipeter op en neer om een enkele celvering te garanderen. Hiervoor kan een 40 μm celzeef worden gebruikt.
  7. Tel de cellen in de hemocytometer en bereken de celconcentratie van de celsuspensie. Profiteer van deze stap om de observatie van een enkele cel suspensie te garanderen. Voorzichtig celtelling is essentieel om de effecten van behandelingen nauwkeurig te kwantificeren.
  8. Hang de vastgestelde hoeveelheid celvering in SCM compleet medium en over te dragen aan poly-HEMA gecoate gerechten. Als referentiewaarde voor zaaidichtheid u rekening houden met 500 tot 2000 cellen/cm2.
    OPMERKING: Optimalisatie van de zaaidichtheid en de tijd van de cultuur voor elke cellijn wordt ten zeerste aanbevolen24.
  9. Incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 2 dagen zonder de platen te storen.
  10. Herstel de concentratie van groeifactoren door 10 ng/mL EFG en 10 ng/mL bFGF toe te voegen aan de celkweekmedia. Herhaal deze stap om de twee dagen.
  11. Incubeer bij 37 °C en 5% CO2 tot 5 dagen na beplating (dit kan variëren van 3 tot 12 dagen volgens de cellijn) om bollen te verkrijgen, die de morfologie van suspensiebolvormige celkolonies presenteren.
  12. Gebruik of verzamel de bollen, door te beaaiden, voor de experimenten.
  13. Om afgeleide aanhangende populaties te verkrijgen, plaats de bollen in standaard cultuurvoorwaarden, respectievelijk van de gebruikte cellijn. 1 tot 2 dagen later is het mogelijk om een monolaag van cellen te observeren die rond aanhangende bollen groeien, wat een morfologie vertoont die vergelijkbaar is met de cellijn van oorsprong.

2. Sphere-forming Protocol van menselijke tumormonsters

OPMERKING: Het gebruik van menselijke monsters voor onderzoeksdoeleinden moet voldoen aan de wetgeving van elk land en moeten worden goedgekeurd door de ethische commissie van de betrokken instellingen.

  1. Bereid de transportmedia met DMEM/F12, aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 2% antibiotica-antimycotische oplossing (10.000 U/mL penicilline, 10 mg/mL streptomycine en 25 μg/mL amphotericine B).
  2. Bereid de vergistingsmedia met DMEM/F12, aangevuld met 10% FBS, 1% antibiotica antimycotische oplossing, 1 mg/mL type IV collagenase en 100 μg/mL DNAse I.
  3. Bereid de enzyminactivatiemedia met DMEM/F12 voor, aangevuld met 10% FBS en 1% antibiotica-antimycotische oplossing (10.000 U/mL penicilline, 10 mg/mL streptomycine en 25 μg/mL amphotericine B).
  4. Bereid de SCM voor zoals beschreven in punt 1.2.
  5. Verkrijg het monster tijdens de macroscopische studie van het operatieve stuk zo snel mogelijk na chirurgische verwijdering.
  6. Plaats de monsters in transportmedia en breng ze over naar het laboratorium voor waar de verwerking plaatsvindt. De monsterverwerking moet binnen 1 uur na de inzameling beginnen om het slagingspercentage van de procedure te verbeteren. Pas op voor voorzichtigheid in het verzamelen van monsters. Zorgvuldig omgaan met de monsters. Vermijd het gebruik van necrotische of dichtgeschroeide zones.
  7. Breng onder de steriele stroomkamer het monster naar een schaal en snijd het in kleinere stukken (ongeveer 1 mm3)met een scalpel.
  8. Incubeer het menselijk weefsel in een buis met spijsverteringsmedia in een roterende shaker tot 180 min, bij 37 °C. Identificeer deze buis als Buis A.
  9. Vervang de enzymoplossing om de 15 min.
    1. Verzamel de vergistingsmedia (zonder weefselfragmenten te verwijderen) en breng deze via een 40 μm celzeef over naar een nieuwe buis die half gevuld is met enzyminactivatiemedia. Onderhoud deze buis op kamertemperatuur en identificeer het als Tube B.
    2. Voeg nieuwe verteringsmedia toe aan buis A en breng deze terug naar de roterende shaker bij 37 °C.
    3. Controleer bij elke verzameling de levensvatbaarheid van de cel met behulp van de trypan blauwe uitsluitingsmethode.
    4. Herhaal deze procedure voor 180 min of totdat het aantal cellen aanzienlijk lager is.
  10. Bebroed de weefselfragmenten in buis A in een tweede verteringsoplossing met gelijke delen van accutase en trypsin-EDTA, roerend gedurende 10 min bij 37 °C.
  11. Voeg de enzyminactivatiemedia toe aan buis A en filter de inhoud door een 40 μm celzeef in Buis B.
  12. Centrifugeer de celvering in buis B op 200 x g gedurende 10 min.
  13. Hang de pellet op in SCM en controleer de celconcentratie met behulp van een hemocytometer.
  14. Hang de vastgestelde hoeveelheid celsuspensie in SCM op en breng over op poly-HEMA gecoate gerechten (zie stap 1.1) met een zaaidichtheid van 4000 cellen/cm2.
  15. Incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 2 dagen zonder de platen te storen.
  16. Herstel de concentratie van groeifactoren door 10 ng/mL EFG en 10 ng/mL bFGF toe te voegen aan de celkweekmedia.
    LET OP: Je moet dit elke twee dagen doen.
  17. Incubeer bij 37 °C en 5% CO2 tot 5 dagen na beplating (dit kan variëren tot 12 dagen) om bollen te verkrijgen, die de morfologie van suspensiebalvormige celkolonies presenteren.

Figure 1
Figuur 1: Het verkrijgen van kankercellen uit menselijke endometriumtumormonsters (A) en borst- en gynaecologische kankercellen (B). Menselijke tumormonsters zijn gefragmenteerd, enzymatisch verteerd en verguld in bolkweekmedium tot poly-HEMA gecoate gerechten. De cellijnen van kanker worden losgemaakt, celopschortingen worden geteld, en enige cellen worden verdeeld bij lage dichtheid in poly-HEMA gecoate platen onder aangewezen voorwaarden. De verkregen bollen produceren, wanneer ze onder aanhangende cultuuromstandigheden worden geplaatst, afgeleide aanhangende populaties. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

3. Gebiedsvorming, zelfvernieuwing en gebied sebolprojectie

OPMERKING: Bolvormingcapaciteit is het vermogen van een tumorcelpopulatie om bollen te produceren. Zelfvernieuwing is het vermogen van bolcellen om nieuwe kolonies bolvormige cellen in suspensie te produceren. Het gebied van de bolprojectie is representatief voor het gebied dat door de bol wordt bezet en is dus expressief van hun grootte en het aantal celdelingen dat in een bepaalde periode wordt ondergaan.

  1. Het bepalen van de bolvormende capaciteit
    1. Verzamel na voltooiing van het bolvormende protocol de bollen in een centrifugebuis en centrifuge op 125 x g gedurende 5 min.
    2. Gooi de SCM weg en hang de pellet voorzichtig op in een bekend volume van verse media. Met als doel het concentreren van de bollen om het tellen te vergemakkelijken, schorsen de bollen in een klein mediavolume. Wees voorzichtig niet te verstoren de bollen.
    3. Gebruik een hemocytometer om de bollen met een diameter van meer dan 40 μm te tellen. Als alternatief kunnen bollen direct op de plaat worden geteld met behulp van een microscoop uitgerust met een graticule25 of met behulp van een geautomatiseerd systeem26,27.
    4. Bereken de procentuele verhouding van de verkregen bollen ten opzichte van het aantal cellen dat in eerste instantie is verguld.
  2. Zelfvernieuwing bepalen
    1. Verzamel na voltooiing van het bolvormende protocol de bollen in een centrifugebuis en centrifuge op 125 x g gedurende 5 min.
    2. Gooi de sfeer kweekmedia weg en hang de pellet voorzichtig op in trypsin-EDTA.
    3. Incubeer tot 5 min bij 37 °C.
    4. Voeg enzym inactivatie media en pipetop op en neer om een enkele cel suspensie te garanderen.
    5. Met behulp van een hemocytometer en de trypan blauwe uitsluiting methode, tellen de levensvatbare cellen in de schorsing.
    6. Start het gebiedsvormende protocol zoals beschreven in punt 1.
    7. Gebruik na 8 dagen een hemocytometer om de bollen met een diameter van meer dan 40 μm te tellen.
    8. Bereken de procentuele verhouding van de verkregen bollen ten opzichte van het aantal cellen dat in eerste instantie is verguld.
  3. Het gebied van de bolprojectie bepalen
    1. Om het gebied te evalueren dat door de bollen wordt bezet, verkrijgt u beelden van ten minste 10 willekeurige velden per voorwaarde, in een omgekeerde microscoop uitgerust met een beeldverwervingsmodule. Een vergroting van 100X tot 400X wordt aanbevolen.
    2. Analyseer afbeeldingen met behulp van imaging software, zoals ImageJ software28,door het tekenen van gebieden van belang die overeenkomen met de bollen en het meten van het gebied in pixels.
    3. Bereken het gebied van de bolprojectie als het gemiddelde pixelsgebied gemeten.

4. Kanker stamcel marker beoordeling met Flow Cytometrie

OPMERKING: CD44+/CD24-/laag fenotype werd consequent geassocieerd met borst- en gynaecologische kankercellen. De beschreven procedure kan worden gebruikt om deze en andere celoppervlaktemarkeringen te evalueren.

  1. Verzamel na voltooiing van het bolvormende protocol de bollen in een centrifugebuis en centrifuge op 125 x g gedurende 5 min.
  2. Gooi de SCM weg en hang de pellet voorzichtig op in trypsin-EDTA.
  3. Incubeer tot 5 min bij 37 °C.
  4. Voeg enzym inactivatie media en pipetop op en neer om een enkele cel suspensie te garanderen.
  5. Centrifugeer bij 125 x g gedurende 5 min, gooi de supernatant weg en hang de cellen voorzichtig op in PBS.
  6. Laat de cellen 30 min in suspensie rusten om het herstel van de membraanbevorming te garanderen.
  7. Met behulp van een hemocytometer en de trypan blauwe uitsluiting methode, tellen de cellen in de schorsing.
  8. Pas het celveringsvolume aan op 106 cellen/500 μL.
  9. Incubeer met de monoklonale antilichamen volgens de instructies van de leveranciers (concentratie, tijd, temperatuur en licht/donker) en gezien de experimentset vertegenwoordigd in tabel 2 of de in tabel 1gegeven merkers .
  10. Voer onmiddellijk na de kleuring de flow cytometrische analyse uit met behulp van een flow cytometer met de juiste detectiemodules.
  11. Standaardiseren cytometer setup, volgens protocollen vastgesteld door het EuroFlow Consortium29.
  12. Stel primaire poorten op op basis van de voorwaartse en zijverstrooiing, met uitzondering van puin en dode cellen. Dit kan worden verbeterd door de etikettering met de bijbehorende etikettering met annexin V en gating negatieve cellen.
  13. Stel fluorescentiepoorten in op basis van de onbevlekte monsters en compensatie voor een spectrale overlap met behulp van enkele bevlekte besturingselementen.

5. Kanker Stamcel Marker Assessment met Western Blot

OPMERKING: Naast aldh1 activiteit, hoge expressie van deze marker werd consequent geassocieerd met borst-en gynaecologische kankercellen13,14. De beschreven procedure kan worden gebruikt om deze en andere celmarkeringen te evalueren.

  1. Verzamel na voltooiing van het bolvormende protocol de bollen in een centrifugebuis en centrifuge op 125 x g gedurende 5 min.
  2. Voorbereiding van de hele cellysaten
    1. Leg de centrifugebuizen op ijs en gooi de supernatant weg zonder de pellet te verstoren.
    2. Was de pellet met 1 mL koude PBS en gooi door centrifugeren.
    3. Hang de pellet op in een klein volume (200-500 μL) RIPA lysisbuffer30 (NaCl 150 mM, Tris-HCl 1,50 mM pH 7.4, Triton-X100 1% vol./vol., natriumdeoxycholic zuur 0,5% wt./vol., natrium dodecylsulfaat 0,5% wt./vol.) aangevuld met cOmplete Mini en dithiothreitol 1 mM.
    4. Het handhaven van de monsters koud (op ijs), stuur ze naar vortex en sonicatie met een 30% amplitude.
    5. Centrifugeer de monsters gedurende 15 min bij 14.000 x g in een gekoelde centrifuge op 4 °C.
    6. Breng de supernatants over op nieuwe, goed geïdentificeerde microbuisjes.
    7. Bepaal de eiwitconcentraties met behulp van de BCA of Bradford assays31.
    8. Bewaar de monsters indien nodig bij -80 °C tot verdere analyse van de westelijke vlek.
  3. Uitvoeren van monsterdenaturatie, elektroforese, elektronenoverdracht en eiwitdetectie volgens standaard westerse blotting protocollen, zoals beschreven32,33,34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het bolvormende protocol maakt het mogelijk om sferische kolonies te verkrijgen in suspensie uit verschillende endometrium- en borstkankercellijnen(figuur 2A)of na zachte enzymatische vertering van weefsel uit menselijke tumormonsters(figuur 2E). In beide gevallen, een paar dagen na beplating, monoklonale bolvormige kolonies in suspensie worden verkregen. Zowel endometrium als borstkankerbollen geven aanleiding tot een celmonolayer met vergelijkbare morfologie als de cellijn van oorsprong, 1 tot 2 dagen na beplating (figuur 2A).

Verschillende afstammingen en weefseloorsprong kunnen worden vergeleken door het bolvormende vermogen, zelfvernieuwings- en projectiegebied. Representatieve resultaten van borstkankercellijnen kunnen worden waargenomen in de grafieken in figuur 2B-D. De hormonale receptor-positieve borstkanker MCF7 cellen vertonen een hogere bol-vormende capaciteit, zelf-vernieuwing en projectie gebied dan de drievoudige negatieve borstkankercellen HCC180614. Voor beide cellijnen is een klein percentage van de cellen verguld (minder dan 3%) was in staat om bollen te produceren die de nadruk leggen op kankercellen als een minderheidspopulatie binnen heterogeniteit van tumorcellen. De zelf-vernieuwing van de kankercellen werd gepatenteerd door een beduidend verschillende waarde van bolzelf-vernieuwing van de vertegenwoordigde cellijnen. Sphere projectie gebied, als een ruwe meting van de afmetingen van de bollen, correleert met het aantal mitotische cycli en geeft verschillende tijdsintervallen voor beide geslachten.

Hoewel slechts een klein deel van de cellen in staat is tumorsferen in vitro te vormen en zelfvernieuwingsvermogen te behouden dat stamcelleneigenschappen draagt, werden verschillende markers geassocieerd met dit fenotype.

Het gepresenteerde stroomcytometrieprotocol maakt veelzijdige experimentele benaderingen mogelijk, gezien oppervlakteantigenen (zie tabel 1). Representatieve resultaten, weergegeven in figuur 3A-B, hebben betrekking op CD44/CD24 en CD133 membraanmarkers die zijn voorgesteld als overeenkomend met een meer kankerstamcel-achtig fenotype. Analyse van de uit endometriumRL95-2 en ECC-1 cellijnen verkregen gebieden kon worden geïdentificeerd (figuur 3A). Bollen verkregen uit endometrium RL95-2 bestond uit een CD44hoog/ CD24- bevolking drie keer groter dan de ouderlijke cel lijn35. In het geval van ECC-1 bollen, de CD44hoog/ CD24- komt overeen met de belangrijkste bevolking, die ook CD133 positief, terwijl de CD44laag/ CD24-, CD44laag/ CD24+ en CD44-/ CD24+ hebben negatieve of lage CD133 expressie.

Het beoordelen van oppervlakte- en intracellulaire markers kan ook worden uitgevoerd door westerse vlek na zachte bol oogsten en zorgvuldige eiwit monster voorbereiding. Figuur 3C toont typische resultaten van ALDH-verandering, een marker waarvan de verhoogde activiteit of verhoogde eiwitexpressie wordt geassocieerd met het kankerstamcelfenotype13,14 op bollen en afgeleide aanhangende cellen met betrekking tot de endometrium ECC1-cellijn van oorsprong.

Figure 2
Figuur 2: Endometrium- en borstkankercellen, bolletjes en afgeleide aanhangende populaties. (A) . Representatieve beelden van endometrium (RL95-2 en ECC-1) en borst (MCF7 en HCC1806) kankercellijnen, respectievelijk endometrium (ES1) en borst (MS1) bollen en afgeleide aanhangende populaties (G1). Representatieve beelden van RL95-2, ECC-1, MCF7 en HCC1806 kankercellijnen werden verkregen bij een vergroting van 200x (Schaalbalk = 50 μm). Representatieve beelden van ES1 RL95-2 en ES1 ECC-1 werden verkregen bij een vergroting van 200x (Schaalbalk = 50 μm). Representatieve afbeeldingen van MS1 MCF7 en MS1 HCC1806 werden verkregen bij een vergroting van 200x (Schaalbalk = 100 μm). Representatieve afbeeldingen van G1 RL95-2 en G1 ECC-1 werden verkregen bij een vergroting van 200x (Schaalbalk = 50 μm). Representatieve afbeeldingen van G1 MCF7 en G1 HCC1806 werden verkregen bij een vergroting van 200x (Schaalbalk = 100 μm). (B-D) . Bolvormingcapaciteit, zelfvernieuwing en sfeerprojectiegebied van borstkankerbollen MCF7 en HCC1806. (E) . Representatieve beelden van bollen verkregen uit menselijke endometrium tumor monsters. Deze beelden werden vastgelegd bij een vergroting van 200x (Schaalbalk = 50 μm). Een deel van dit cijfer is gewijzigd van een eerdere publicatie met toestemming van de uitgever14. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Gecombineerde evaluatie van kankercellen markers in endometrium kankercellen. (A) . Representatieve percelen cd44/CD24-etikettering van de RL95-2-cellijn en van de RL95-2-bolcellen. b) . Representatieve histogrammen van CD133-etikettering van bolcellen (ES1) verkregen uit RL95-2- en ECC-1-cellijnen. Dichtheid vertegenwoordigt een maat voor het aantal cellen. CD44+/CD24-CD44low/CD24-, CD44low/CD24± en CD44-/CD24+ populaties zijn respectievelijk in groen, roze, blauw en geel geschilderd. C. ALDH-expressie in ECC-1-cellijn, bollen (ES1) en afgeleide aanhangende populatie (G1). De immunoblot vertegenwoordigt de ALDH en actine expressie voor de respectieve experimentele omstandigheden. ALDH expressie werd geëvalueerd met het antilichaam ALDH1/2, die de isovormen ALDH1A1, ALDH1A2, ALDH1A3 en ALDH2 van muis, rat en menselijke oorsprong detecteert. Een deel van dit cijfer is gewijzigd uit eerdere publicaties met toestemming van de uitgevers13. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Tabel 1: Lijst van gynaecologische en borstkanker stamcellen markers.

Markering Oorsprong van stamcellen Verwijzingen
CD24 Eierstokkanker 60
CD29 Borstkanker 61
CD44 Eierstokkanker 62,63
CD44/CD24-/laag Borstkanker 13,5,3,64
CD44+/CD24-/laag/ESA Borstkanker 65
CD44/ALDH1+/hi Borstkanker 66
CD44/CD24-/laag/ABCG2 Borstkanker 67
CD44/CD24-/laag/ALDH1 Borstkanker 43,68,69
CD44/CD24-/laag/EpCAM Borstkanker 5
CD44/CD24-/laag/SSEA-3 Borstkanker 70
CD44/CD49f/CD133/2 Borstkanker 71
CD44/CD133/ALDH1+/hi Borstkanker 69
CD44/CD117 Eierstokkanker 7
CD44/MyD88 Eierstokkanker 72,73
CD44/E-cadherin-/CD34- Eierstokkanker 74,75
CD44/CD24/Epcam Eierstokkanker 76,77
CD44/CD24- Eierstokkanker 78,79
CD44/CD166 Eierstokkanker 80
CD44/CD24 Baarmoederhalskanker 81
CD49f Borstkanker 4
Baarmoederhalskanker 82
CD117 of c-Kit Endometriumkanker 83
Eierstokkanker 62,84
CD133 Borstkanker 4,85
Eierstokkanker 62,86
Endometriumkanker 13,87,88,89
Baarmoederhalskanker 82
CD133hi/CXCR4hi/ALDH1hi Borstkanker 90
CD133/ALDH1 Borstkanker 91
Eierstokkanker 60,92
CD133/CXCR4 Endometriumkanker 93
ABCG2 (ABCG2) Borstkanker 65
Baarmoederhalskanker 82,81
ALDH-1 Borstkanker 4
Endometriumkanker 94,95
Baarmoederhalskanker 82
CXCR4 of CD184 Borstkanker 96
EpCAM/CD49f Borstkanker 97
EpCAMhi/PROCRhi/SSEA-3 Borstkanker 70
GD2/GD3/GD3Shi Borstkanker 98
ITGA6 (ITGA6) Borstkanker 4
PROCR Borstkanker 43

OPMERKING: Deze tabel bevat een lijst van oppervlakteepitopjes uitgedrukt door verschillende gynaecologische en borstkankerstamcellen; de meeste van deze markers worden ook uitgedrukt door een reeks andere weefsels. Deze lijst is niet bedoeld om alle gerapporteerde markeringen op te nemen.

Tabel 2: Lijst van buizen die moeten worden opgenomen in een typisch stroomcytometrieexperiment om het FENOtype CD24/CD44 te evalueren. De tabel toont een minimale set monsterbuizen die nodig zijn voor een co-kleuringsexperiment, inclusief de nodige controles.

Buis Voorwaarde Antigeenfluor
1 Onbevlekte cellen Geen
2 Single gekleurde CD44 CD44-PE
3 Single gekleurde CD24 CD24-APC
4 Cd44/CD24 met dubbele stained CD44-PE en CD24-APC

OPMERKING: Dit experiment kan worden uitgevoerd door inbijlage in V-FICT aan buis 4 toe te voegen en de desbetreffende besturingsbuis toe te voegen om de annex in V-negatieve cellen te sluiten en eventuele cellen in apoptose uit te sluiten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit protocol beschrijft een aanpak om tumorsferen te verkrijgen van kankercellijnen en primaire menselijke monsters. Tumorsferen zijn verrijkt in een subpopulatie met stamcelachtige eigenschappen36. Deze verrijking in CSC is afhankelijk van de levensvatbaarheid in een ankerplaatsvrije omgeving, terwijl gedifferentieerde cellen afhankelijk zijn van hechting aan een substraat37. Aangezien primaire beplating van tumorcellen in een lage hechtingsomgeving die schorsing oplegt, geen verrijking garandeert in CSC per se, bieden we strategieën om zelfvernieuwing (bolvormend vermogen en zelfvernieuwing), differentiatiecapaciteit (afgeleide aanhangende populaties) en fenotype van CSC (met stroomcytometrie en/of westerse vlek) te evalueren. Kankercellen kunnen worden geïdentificeerd via verschillende breed beschreven fenotypische markers (zie tabel 1).

Aangezien primaire culturen van de menselijke tumor vaak een uitdaging zijn om cultuur vast te stellen en te behouden, kan het gebiedsvormende protocol een hulpmiddel zijn voor het hanteren van deze monsters. De enzymatische spijsverteringsprocedure suggereerde eencellige suspensingen van endometriumweefselmonsters38. Het gebiedsvormende protocol biedt aanzienlijke aantallen CSC, die moeilijk te verkrijgen zijn met andere middelen. Het driedimensionale model zou efficiënter kunnen zijn in het nabootsen van de in vivo situatie, namelijk de fysiologische micro-omgeving en tumorhetgeeniteit, dan conventionele monolayer celculturen.

De zekerheid over de monoklonale oorsprong van tumorsferen is een kritieke stap van dit protocol. Het minimaliseren van aggregatie, die de neiging heeft om voor te komen in suspensieculturen, en een grondige optimalisatie van zaaiden dichtheden om eencellige suspensing te distribueren zijn cruciaal24. Andere auteurs stelden de beplating van een enkele cel per put39,40. Om deze moeizame procedure te voorkomen, hebben we dit probleem overwonnen door ervoor te zorgen dat een eencellige suspensie in een lage dichtheid wordt verguld in een met methylcellulose verrijkt medium. Vanwege het watervasthouden en viscositeit verbeteren eigenschappen23, methylcellulose biedt een semi-solide medium dat migratie en aggregatie voorkomt, zorgen voor de monoklonaleiteit van de bollen verkregen21. Het aantal dagen in de cultuur is een ander aspect dat afhankelijk is van optimalisatie, omdat het aantal dagen dat nodig is om bollen te verkrijgen met diameters van meer dan 40 μm afhankelijk is van elk celtype verdubbelingstijd24. Het lage of serumvrije medium is een ander kenmerk van het protocol, aangezien FBS-bevattend medium relevant is voor gedifferentieerde celgroei in aanhangende omstandigheden41, zoals in de ouderlijke cellijnen en in de afgeleide aanhangende cellen. Het protocol is afhankelijk van het behoud van een gestage concentratie van de specifieke groeifactoren. EFG-signalering speelt een belangrijke rol bij het behoud van pluripotentietrajecten, terwijl bFGF fungeert als mitogen ecogeen die bijdraagt aan de generatie van bollen42,43.

Het gebiedsvormende protocol, dat verband houdt met de juiste technieken, biedt de middelen om specifieke populaties van CSC21uit te breiden, te isoleren en te evalueren . Verschillende auteurs hebben gewezen op het nut ervan bij de beoordeling van stamcelgenexpressie44,45,46,47 en stamness in tumoren47,48, om epitheel-mesenchymale overgang44,49 en tumorigenese45,48,te bestuderen om het effect van nieuwe therapieën te evalueren21,50 en resistentie tegen geneesmiddelen44, 51, en om culturen uit primaire monsters te vestigen21,45,46. Het is echter belangrijk om in gedachten te houden dat het een gevoelig experiment is, dat sterk afhankelijk is van adequate cultuuromstandigheden. Bovendien, de bollen presenteren cellulaire heterogeniteit als gevolg van CSC asymmetrische afdeling52 en vertegenwoordigen geen goed model van de complexiteit van de vorming van kanker stamcellen en onderhoud in de in vivo niche46.

Naast het bolvormende protocol zijn ook andere functionele testen gebruikt voor de detectie van CSC. In vivo brengt tumorigeniciteit de inenting van lage celaantallen in immuungecompromitteerde muizen met zich mee om tumoren te verkrijgen36,53. Dit hangt af van de beschikbaarheid van de juiste omstandigheden om dierproeven uit te voeren, en vanwege de niet-soortspecifieke microomgeving kan het herstel van levende cellen een uitdaging zijn. Een kolonie vormen de eenheid test, evaluatie van de cel vermogen om kolonies te genereren nadat ze zijn verguld bij een lage dichtheid52, biedt lage celnummers. Zij-populatie is afhankelijk van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) om een groep cellen te isoleren met de mogelijkheid om de Hoescht 33342 vlek extrudert. Deze gevoelige methode is gebaseerd op de expressie van ATP binding cassette eiwit (ABC) vervoerders, verantwoordelijk voor drug efflux54. Niettemin wordt de zijdepopulatie in verband gebracht met enkele nadelen, namelijk niet-specificiteit voor sommige fenotypen CSC en de kenmerken van de kleurstof, die giftig is en grotendeels wordt beïnvloed door experimentele omstandigheden (temperatuur, concentratie)54,55. ALDEFLUOR is een andere flow cytometrie-gebaseerde test voor de identificatie van cellen met intracellulaire ALDH activiteit. Het belangrijkste punt is het gebrek aan reproduceerbaarheid tussen studies die sterk lijken te worden beïnvloed door de cultuuromstandigheden54.

Het gebiedsvormende protocol wordt vaak gecombineerd met fenotypische analyse, zoals we hier hebben voorgesteld, waarbij de nadruk wordt gelegd op het nut van complementaire methoden om CSC13,14te identificeren . We hebben CSC-verrijking aanbevolen via het bolvormende protocol en verdere bevestiging van de stemkracht via de beoordeling van biochemische markers door stromingscytometrie en westelijke vlek. Flow cytometrie studies geïdentificeerd heterogene populaties binnen de sferen. In feite is er een verrijking in CSC in de studies getoond, vertegenwoordigd in dit protocol door de CD44hoge/ CD24lage cellen. Als gevolg van CSC asymmetrische zelf-vernieuwing24,andere cel fenotypes werden ook geïdentificeerd. In het geval van CD133 bleek uit representatieve resultaten dat de populatie met een hogere stam positief was in het geval van de ECC-1-cellijn, maar negatief in RL95-2-sferen. Dit wijst op het gebrek aan specificiteit van sommige beschreven CSC-markeringen, die niet uniek zijn voor deze cellen en kunnen variëren met de plasticiteit van het fenotype, en op het belang van het gebruik van een combinatie van strategieën om de stamte bevestigen.

Westerse vlek is een alternatieve methode die nuttig kan zijn in bepaalde gevallen. Hoewel de ALDH-activiteit bijvoorbeeld in grote lijnen wordt gebruikt, is het nu bekend dat meerdere isovormen bijdragen aan aldefluor-metabolisatie54. Zo zouden specifieke antigeenantie-antilichaammethoden betrouwbaarder kunnen zijn en toonden we al de associatie tussen ALDH-eiwitexpressie en stamkracht13,14.

Bolvormend vermogen, zelfvernieuwing en afgeleide aanhangende populaties vertegenwoordigen het vermogen van CSC om voor onbepaalde tijd een gedifferentieerd nageslacht te verdelen en te produceren, wat zich klinisch vertaalt naar gebeurtenissen zoals terugval, metastisatie en resistentie tegen behandeling9. Resistentie tegen geneesmiddelen in CSC kan worden verklaard door overexpressie van multidrug resistentie (MDR) membraan eiwitten, ALDH expressie die betrokken zijn bij ontgifting mechanismen, DNA reparatie mechanismen, bescherming tegen reactieve zuurstofsoorten en weerstand tegen apoptose56. CSC heeft de capaciteit om te worden rustig als gevolg van hun plasticiteit en dit is naar voren gekomen als een mechanisme van resistentie tegen geneesmiddelen. Deze populatie kan worden gespaard van chemo- en radiotherapie als gevolg van cel-cyclus gearresteerd gedifferentieerde cellen57. Bollen zijn een tumorpopulatie met gerapporteerde resistentie tegen cytostatische geneesmiddelen die worden gebruikt bij conventionele behandeling en zijn ook een focus geweest voor combinatie met gerichte therapieën54,58,59. De gevoeligheid van bollen kan worden getest op cytostatica gebruikt bij borst- en endometriumkanker. Bovendien kan de isolatie van CSC van een tumormonster een platform zijn voor de klinische toepassing van therapie die specifiek is voor elke tumor, waardoor resistentie en de daaruit voortvloeiende terugkerende ziekte wordt voorspeld.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Deze studie werd gefinancierd door de Portugese Vereniging van Gynaecologie via de Onderzoeksprijs 2016 en door CIMAGO. Cnc. IBILI wordt ondersteund door de Foundation for Science and Technology, Portugal (UID/NEU/04539/2013) en mede gefinancierd door FEDER-COMPETE (POCI-0145-FEDER-007440). Het Coimbra Hospital and Universitary Center (CHUC) Tumor Bank, goedgekeurd door chuc's Ethics Committee for Health en door de Portugese National Data Protection Commission, was de bron van endometrium monsters van patiënten gevolgd bij de instelling Gynaecologie Service. Figuur 1 werd geproduceerd met behulp van Servier Medical Art, verkrijgbaar bij www.servier.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute ethanol Merck Millipore 100983
Accutase Gibco A1110501 StemPro Accutas Cell Dissociation Reagent
ALDH antibody Santa Cruz Biotechnology SC166362
Annexin V FITC BD Biosciences 556547
Antibiotic antimycotic solution Sigma A5955
BCA assay Thermo Scientific 23225 Pierce BCA Protein Assay Kit
Bovine serum albumin Sigma A9418
CD133 antibody Miteny Biotec 293C3-APC Allophycocyanin (APC)
CD24 antibody BD Biosciences 658331 Allophycocyanin-H7 (APC-H7)
CD44 antibody Biolegend 103020 Pacific Blue (PB)
Cell strainer BD Falcon 352340 40 µM
Collagenase, type IV Gibco 17104-019
cOmplete Mini Roche 118 361 700 0
Dithiothreitol Sigma 43815
DMEM-F12 Sigma D8900
DNAse I Roche 11284932001
ECC-1 ATCC CRL-2923 Human endometrium adenocarcinoma cell line
Epidermal growth factor Sigma E9644
Fibroblast growth factor basic Sigma F0291
Haemocytometer VWR HERE1080339
HCC1806 ATCC CRL-2335 Human mammary squamous cell carcinoma cell line
Insulin, transferrin, selenium Solution Gibco 41400045
MCF7 ATCC HTB-22 Human mammary adenocarcinoma cell line
Methylcellulose AlfaAesar 45490
NaCl JMGS 37040005002212
Poly(2-hydroxyethyl-methacrylate Sigma P3932
Putrescine Sigma P7505
RL95-2 ATCC CRL-1671 Human endometrium carcinoma cell line
Sodium deoxycholic acid JMS EINECS 206-132-7
Sodium dodecyl sulfate Sigma 436143
Tris JMGS 20360000BP152112
Triton-X 100 Merck 108603
Trypan blue Sigma T8154
Trypsin-EDTA Sigma T4049
ß-actin antibody Sigma A5316

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hardin, H., Zhang, R., Helein, H., Buehler, D., Guo, Z., Lloyd, R. V. The evolving concept of cancer stem-like cells in thyroid cancer and other solid tumors. Laboratory Investigation. 97 (10), 1142 (2017).
  2. Plaks, V., Kong, N., Werb, Z. The Cancer Stem Cell Niche: How Essential Is the Niche in Regulating Stemness of Tumor Cells? Cell Stem Cell. 16 (3), 225-238 (2015).
  3. Visvader, J. E., Lindeman, G. J. Cancer stem cells in solid tumours accumulating evidence and unresolved questions. Nature reviews. Cancer. 8, 755-768 (2008).
  4. Allegra, A., et al. The Cancer Stem Cell Hypothesis: A Guide to Potential Molecular Targets. Cancer Investigation. 32 (9), 470-495 (2014).
  5. Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (7), 3983-3988 (2003).
  6. Friel, A. M., et al. Functional analyses of the cancer stem cell-like properties of human endometrial tumor initiating cells. Cell Cycle. 7 (2), 242-249 (2008).
  7. Zhang, S., et al. Identification and Characterization of Ovarian Cancer-Initiating Cells from Primary Human Tumors. Cancer Research. 68 (11), 4311-4320 (2008).
  8. Bapat, S. A., Mali, A. M., Koppikar, C. B., Kurrey, N. K. Stem and progenitor-like cells contribute to the aggressive behavior of human epithelial ovarian cancer. Cancer research. 65 (8), 3025-3029 (2005).
  9. Carvalho, M. J., Laranjo, M., Abrantes, A. M., Torgal, I., Botelho, M. F., Oliveira, C. F. Clinical translation for endometrial cancer stem cells hypothesis. Cancer and Metastasis Reviews. 34 (3), 401-416 (2015).
  10. Morel, A. P., Lièvre, M., Thomas, C., Hinkal, G., Ansieau, S., Puisieux, A. Generation of Breast Cancer Stem Cells through Epithelial-Mesenchymal Transition. PLoS ONE. 3 (8), e2888 (2008).
  11. Tirino, V., et al. Cancer stem cells in solid tumors: an overview and new approaches for their isolation and characterization. The FASEB Journal. 27 (1), 13 (2013).
  12. Ajani, J. A., et al. ALDH-1 expression levels predict response or resistance to preoperative chemoradiation in resectable esophageal cancer patients. Molecular Oncology. 8 (1), 142-149 (2014).
  13. Carvalho, M. J., et al. Endometrial Cancer Spheres Show Cancer Stem Cells Phenotype and Preference for Oxidative Metabolism. Pathology and Oncology Research. , (2018).
  14. Laranjo, M., et al. Mammospheres of hormonal receptor positive breast cancer diverge to triple-negative phenotype. The Breast. 38, 22-29 (2018).
  15. Cui, M., et al. Non-Coding RNA Pvt1 Promotes Cancer Stem Cell–Like Traits in Nasopharyngeal Cancer via Inhibiting miR-1207. Pathology & Oncology Research. , (2018).
  16. Deng, S., et al. Distinct expression levels and patterns of stem cell marker, aldehyde dehydrogenase isoform 1 ALDH1), in human epithelial cancers. PloS one. 5 (4), e10277 (2010).
  17. Weiswald, L. B., Guinebretière, J. M., Richon, S., Bellet, D., Saubaméa, B., Dangles-Marie, V. In situ protein expression in tumour spheres: development of an immunostaining protocol for confocal microscopy. BMC Cancer. 10 (1), 106 (2010).
  18. Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical Cancer Models in Tumor Biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
  19. Picon-Ruiz, M., et al. Low adherent cancer cell subpopulations are enriched in tumorigenic and metastatic epithelial-to-mesenchymal transition-induced cancer stem-like cells. Scientific Reports. 6 (1), 1-13 (2016).
  20. Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes & development. 17 (10), 1253-1270 (2003).
  21. Ballout, F., et al. Sphere-Formation Assay: Three-Dimensional in vitro Culturing of Prostate Cancer Stem/Progenitor Sphere-Forming Cells. Frontiers in Oncology. 8 (August), 1-14 (2018).
  22. Ishiguro, T., Ohata, H., Sato, A., Yamawaki, K., Enomoto, T., Okamoto, K. Tumor-derived spheroids: Relevance to cancer stem cells and clinical applications. Cancer Science. 108 (3), 283-289 (2017).
  23. Noseda, M., Nasatto, P., Silveira, J., Pignon, F., Rinaudo, M., Duarte, M. Methylcellulose, a Cellulose Derivative with Original Physical Properties and Extended Applications. Polymers. 7 (5), 777-803 (2015).
  24. Shaw, F. L., et al. A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).
  25. Zhou, M., et al. LncRNA-Hh Strengthen Cancer Stem Cells Generation in Twist-Positive Breast Cancer via Activation of Hedgehog Signaling Pathway. Stem cells (Dayton, Ohio). 34 (1), 55-66 (2016).
  26. Ha, J. R., et al. Integration of Distinct ShcA Signaling Complexes Promotes Breast Tumor Growth and Tyrosine Kinase Inhibitor Resistance. Molecular cancer research MCR. 16 (5), 894-908 (2018).
  27. Jurmeister, S., et al. Identification of potential therapeutic targets in prostate cancer through a cross-species approach. EMBO molecular medicine. 10 (3), (2018).
  28. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  29. Kalina, T., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).
  30. Peach, M., Marsh, N., Miskiewicz, E. I., MacPhee, D. J. Solubilization of Proteins: The Importance of Lysis Buffer Choice. , 49-60 (2015).
  31. Olson, B. J. S. C. Assays for Determination of Protein Concentration. Current Protocols in Pharmacology. , A.3A.1-A.3A.32 (2016).
  32. Eslami, A., Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. Journal of Visualized Experiments. (44), 1-2 (2010).
  33. Silva, J. M., McMahon, M. The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis. Journal of Visualized Experiments. 84 (84), 1-8 (2014).
  34. Oldknow, K. J., et al. A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies. Journal of Visualized Experiments. 8 (93), 1-10 (2014).
  35. Serambeque, B. Células estaminais do cancro do endométrio - a chave para o tratamento personalizado? [Stem Cells of Endometrial Cancer: The Key to Personalized Treatment?]. , University of Coimbra. Master thesis (2018).
  36. Lee, C. H., Yu, C. C., Wang, B. Y., Chang, W. W. Tumorsphere as an effective in vitro platform for screening anti-cancer stem cell drugs. Oncotarget. 7 (2), (2015).
  37. De Luca, A., et al. Mitochondrial biogenesis is required for the anchorage-independent survival and propagation of stem-like cancer cells. Oncotarget. 6 (17), (2015).
  38. Masuda, A., et al. An improved method for isolation of epithelial and stromal cells from the human endometrium. Journal of Reproduction and Development. 62 (2), 213-218 (2016).
  39. Del Rio-Tsonis, K., et al. Facile isolation and the characterization of human retinal stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (44), 15772-15777 (2004).
  40. Wang, L., Guo, H., Lin, C., Yang, L., Wang, X. I. Enrichment and characterization of cancer stem-like cells from a cervical cancer cell line. Molecular Medicine Reports. 9 (6), 2117-2123 (2014).
  41. Chen, Y. C., et al. High-throughput single-cell derived sphere formation for cancer stem-like cell identification and analysis. Scientific Reports. 6 (April), 1-12 (2016).
  42. Kim, J., Jung, J., Lee, S. J., Lee, J. S., Park, M. J. Cancer stem-like cells persist in established cell lines through autocrine activation of EGFR signaling. Oncology Letters. 3 (3), 607-612 (2012).
  43. Hwang-Verslues, W. W., et al. Multiple Lineages of Human Breast Cancer Stem/Progenitor Cells Identified by Profiling with Stem Cell Markers. PloS one. 4 (12), e8377 (2009).
  44. Feng, Y., et al. Metformin reverses stem cell-like HepG2 sphere formation and resistance to sorafenib by attenuating epithelial-mesenchymal transformation. Molecular Medicine Reports. 18 (4), 3866-3872 (2018).
  45. Wang, H., Paczulla, A., Lengerke, C. Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays. Journal of Visualized Experiments. (95), 1-11 (2015).
  46. Stebbing, J., Lombardo, Y., Coombes, C. R., de Giorgio, A., Castellano, L. Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. (97), 1-5 (2015).
  47. Zhao, H., et al. Sphere-forming assay vs. organoid culture: Determining long-term stemness and the chemoresistant capacity of primary colorectal cancer cells. International Journal of Oncology. 54 (3), 893-904 (2019).
  48. Bagheri, V., et al. Isolation and identification of chemotherapy-enriched sphere-forming cells from a patient with gastric cancer. Journal of Cellular Physiology. 233 (10), 7036-7046 (2018).
  49. Kaowinn, S., Kaewpiboon, C., Koh, S., Kramer, O., Chung, Y. STAT1-HDAC4 signaling induces epithelial-mesenchymal transition and sphere formation of cancer cells overexpressing the oncogene, CUG2. Oncology Reports. , 2619-2627 (2018).
  50. Lonardo, E., Cioffi, M., Sancho, P., Crusz, S., Heeschen, C. Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies. Journal of Visualized Experiments. (100), 1-9 (2015).
  51. Lu, H., et al. Targeting cancer stem cell signature gene SMOC-2 Overcomes chemoresistance and inhibits cell proliferation of endometrial carcinoma. EBioMedicine. 40, 276-289 (2019).
  52. Bu, P., Chen, K. Y., Lipkin, S. M., Shen, X. Asymmetric division: a marker for cancer stem cells. Oncotarget. 4 (7), (2013).
  53. Islam, F., Qiao, B., Smith, R. A., Gopalan, V., Lam, A. K. Y. Cancer stem cell: fundamental experimental pathological concepts and updates. Experimental and molecular pathology. 98 (2), 184-191 (2015).
  54. Liu, W., et al. Comparative characterization of stem cell marker expression, metabolic activity and resistance to doxorubicin in adherent and spheroid cells derived from the canine prostate adenocarcinoma cell line CT1258. Anticancer research. 35 (4), 1917-1927 (2015).
  55. Broadley, K. W. R., et al. Side Population is Not Necessary or Sufficient for a Cancer Stem Cell Phenotype in Glioblastoma Multiforme. STEM CELLS. 29 (3), 452-461 (2011).
  56. Cojoc, M., Mäbert, K., Muders, M. H., Dubrovska, A. A role for cancer stem cells in therapy resistance: Cellular and molecular mechanisms. Seminars in Cancer Biology. 31, 16-27 (2015).
  57. Batlle, E., Clevers, H. Cancer stem cells revisited. Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).
  58. Zhang, X. L., Jia, Q., Lv, L., Deng, T., Gao, J. Tumorspheres Derived from HCC Cells are Enriched with Cancer Stem Cell-like Cells and Present High Chemoresistance Dependent on the Akt Pathway. Anti-cancer agents in medicinal chemistry. 15 (6), 755-763 (2015).
  59. Fukamachi, H., et al. CD49fhigh Cells Retain Sphere-Forming and Tumor-Initiating Activities in Human Gastric Tumors. PLoS ONE. 8 (8), e72438 (2013).
  60. Gao, M. Q., Choi, Y. P., Kang, S., Youn, J. H., Cho, N. H. CD24+ cells from hierarchically organized ovarian cancer are enriched in cancer stem cells. Oncogene. 29 (18), 2672-2680 (2010).
  61. Cariati, M., et al. Alpha-6 integrin is necessary for the tumourigenicity of a stem cell-like subpopulation within the MCF7 breast cancer cell line. International Journal of Cancer. 122 (2), 298-304 (2008).
  62. López, J., Valdez-Morales, F. J., Benítez-Bribiesca, L., Cerbón, M., Carrancá, A. Normal and cancer stem cells of the human female reproductive system. Reproductive Biology and Endocrinology. 11 (1), 53 (2013).
  63. Alvero, A. B., et al. Molecular phenotyping of human ovarian cancer stem cells unravels the mechanisms for repair and chemoresistance. Cell Cycle. 8 (1), 158-166 (2009).
  64. Charafe-Jauffret, E., Ginestier, C., Birnbaum, D. Breast cancer stem cells: tools and models to rely on. BMC Cancer. 9 (1), 202 (2009).
  65. Leccia, F., et al. ABCG2, a novel antigen to sort luminal progenitors of BRCA1- breast cancer cells. Molecular Cancer. 13 (1), 213 (2014).
  66. Croker, A. K., Allan, A. L. Inhibition of aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity reduces chemotherapy and radiation resistance of stem-like ALDHhiCD44+ human breast cancer cells. Breast Cancer Research and Treatment. 133 (1), 75-87 (2012).
  67. Sun, M., et al. Enhanced efficacy of chemotherapy for breast cancer stem cells by simultaneous suppression of multidrug resistance and antiapoptotic cellular defense. Acta Biomaterialia. 28, 171-182 (2015).
  68. Shao, J., Fan, W., Ma, B., Wu, Y. Breast cancer stem cells expressing different stem cell markers exhibit distinct biological characteristics. Molecular Medicine Reports. 14 (6), 4991-4998 (2016).
  69. Croker, A. K., et al. High aldehyde dehydrogenase and expression of cancer stem cell markers selects for breast cancer cells with enhanced malignant and metastatic ability. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (8b), 2236-2252 (2009).
  70. Cheung, S. K. C., et al. Stage-specific embryonic antigen-3 (SSEA-3) and β3GalT5 are cancer specific and significant markers for breast cancer stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (4), 960-965 (2016).
  71. Meyer, M. J., Fleming, J. M., Lin, A. F., Hussnain, S. A., Ginsburg, E., Vonderhaar, B. K. CD44 pos CD49f hi CD133/2 hi Defines Xenograft-Initiating Cells in Estrogen Receptor–Negative Breast Cancer. Cancer Research. 70 (11), 4624-4633 (2010).
  72. Ahn, S. M., Goode, R. J. A., Simpson, R. J. Stem cell markers: Insights from membrane proteomics? PROTEOMICS. 8 (23-24), 4946-4957 (2008).
  73. Chefetz, I., et al. TLR2 enhances ovarian cancer stem cell self-renewal and promotes tumor repair and recurrence. Cell Cycle. 12 (3), 511-521 (2013).
  74. Alvero, A. B., et al. Stem-Like Ovarian Cancer Cells Can Serve as Tumor Vascular Progenitors. Stem Cells. 27 (10), 2405-2413 (2009).
  75. Yin, G., et al. Constitutive proteasomal degradation of TWIST-1 in epithelial–ovarian cancer stem cells impacts differentiation and metastatic potential. Oncogene. 32 (1), 39-49 (2013).
  76. Wei, X., et al. Mullerian inhibiting substance preferentially inhibits stem/progenitors in human ovarian cancer cell lines compared with chemotherapeutics. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (44), 18874-18879 (2010).
  77. Meirelles, K., et al. Human ovarian cancer stem/progenitor cells are stimulated by doxorubicin but inhibited by Mullerian inhibiting substance. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (7), 2358-2363 (2012).
  78. Shi, M. F., et al. Identification of cancer stem cell-like cells from human epithelial ovarian carcinoma cell line. Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (22), 3915-3925 (2010).
  79. Meng, E., et al. CD44+/CD24− ovarian cancer cells demonstrate cancer stem cell properties and correlate to survival. Clinical & Experimental Metastasis. 29 (8), 939-948 (2012).
  80. Witt, A. E., et al. Identification of a cancer stem cell-specific function for the histone deacetylases, HDAC1 and HDAC7, in breast and ovarian. Oncogene. 36 (12), 1707-1720 (2017).
  81. Wu, H., Zhang, J., Shi, H. Expression of cancer stem markers could be influenced by silencing of p16 gene in HeLa cervical carcinoma cells. European journal of gynaecological oncology. 37 (2), 221-225 (2016).
  82. Huang, R., Rofstad, E. K. Cancer stem cells (CSCs), cervical CSCs and targeted therapies. Oncotarget. 8 (21), 35351-35367 (2017).
  83. Zhang, X., et al. Imatinib sensitizes endometrial cancer cells to cisplatin by targeting CD117-positive growth-competent cells. Cancer Letters. 345 (1), 106-114 (2014).
  84. Luo, L., et al. Ovarian cancer cells with the CD117 phenotype are highly tumorigenic and are related to chemotherapy outcome. Experimental and Molecular Pathology. 91 (2), 596-602 (2011).
  85. Zhao, P., Lu, Y., Jiang, X., Li, X. Clinicopathological significance and prognostic value of CD133 expression in triple-negative breast carcinoma. Cancer Science. 102 (5), 1107-1111 (2011).
  86. Ferrandina, G., et al. Expression of CD133-1 and CD133-2 in ovarian cancer. International Journal of Gynecologic Cancer. 18 (3), 506-514 (2008).
  87. Rutella, S., et al. Cells with characteristics of cancer stem/progenitor cells express the CD133 antigen in human endometrial tumors. Clinical cancer research an official journal of the American Association for Cancer Research. 15 (13), 4299-4311 (2009).
  88. Friel, A. M., et al. Epigenetic regulation of CD133 and tumorigenicity of CD133 positive and negative endometrial cancer cells. Reproductive Biology and Endocrinology. 8 (1), 147 (2010).
  89. Nakamura, M., et al. Prognostic impact of CD133 expression as a tumor-initiating cell marker in endometrial cancer. Human Pathology. 41 (11), 1516-1529 (2010).
  90. Saha, S. K., et al. KRT19 directly interacts with β-catenin/RAC1 complex to regulate NUMB-dependent NOTCH signaling pathway and breast cancer properties. Oncogene. 36 (3), 332-349 (2017).
  91. LV, X., Wang, Y., Song, Y., Pang, X., Li, H. Association between ALDH1+/CD133+ stem-like cells and tumor angiogenesis in invasive ductal breast carcinoma. Oncology Letters. 11 (3), 1750-1756 (2016).
  92. Ruscito, I., et al. Exploring the clonal evolution of CD133/aldehyde-dehydrogenase-1 (ALDH1)-positive cancer stem-like cells from primary to recurrent high-grade serous ovarian cancer (HGSOC). A study of the Ovarian Cancer Therapy–Innovative Models Prolong Survival (OCTIPS). European Journal of Cancer. 79, 214-225 (2017).
  93. Sun, Y., et al. Isolation of Stem-Like Cancer Cells in Primary Endometrial Cancer Using Cell Surface Markers CD133 and CXCR4. Translational Oncology. 10 (6), 976-987 (2017).
  94. Rahadiani, N., et al. Expression of aldehyde dehydrogenase 1 (ALDH1) in endometrioid adenocarcinoma and its clinical implications. Cancer Science. 102 (4), 903-908 (2011).
  95. Mamat, S., et al. Transcriptional Regulation of Aldehyde Dehydrogenase 1A1 Gene by Alternative Spliced Forms of Nuclear Factor Y in Tumorigenic Population of Endometrial Adenocarcinoma. Genes & Cancer. 2 (10), 979-984 (2011).
  96. Mukherjee, S. A., et al. Non-migratory tumorigenic intrinsic cancer stem cells ensure breast cancer metastasis by generation of CXCR4+ migrating cancer stem cells. Oncogene. 35 (37), 4937-4948 (2016).
  97. Lim, E., et al. Aberrant luminal progenitors as the candidate target population for basal tumor development in BRCA1 mutation carriers. Nature Medicine. 15 (8), 907-913 (2009).
  98. Liang, Y. J., et al. Interaction of glycosphingolipids GD3 and GD2 with growth factor receptors maintains breast cancer stem cell phenotype. Oncotarget. 8 (29), 47454-47473 (2017).

Tags

Cancer Research neoplastische stamcellen borstneoplasma's tumorsferen gynaecologische kanker sfeervormingsprotocol kankerstamcelmarkers
Het verkrijgen van kanker stamcelbollen van gynaecologische en borstkankertumoren
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Laranjo, M., Carvalho, M. J.,… More

Laranjo, M., Carvalho, M. J., Serambeque, B., Alves, A., Marto, C. M., Silva, I., Paiva, A., Botelho, M. F. Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors. J. Vis. Exp. (157), e60022, doi:10.3791/60022 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter