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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

स्त्री रोग और स्तन कैंसर ट्यूमर से कैंसर स्टेम सेल क्षेत्रों प्राप्त करना

Published: March 1, 2020 doi: 10.3791/60022
Automatic Translation
*1,2,3,4, *1,2,3,4,5,6, 1,2,3, 2,7, 1,2,3,4,8, 9, 3,9,10, 1,2,3,4,8
1Institute of Biophysics, Faculty of Medicine, University of Coimbra, 2Coimbra Institute for Clinical and Biomedical Research (iCBR), area of Environment Genetics and Oncobiology (CIMAGO), Faculty of Medicine, University of Coimbra, 3CNC.IBILI/Center for Innovative Biomedicine and Biotechnology (CIBB), University of Coimbra, 4Clinical Academic Center of Coimbra (CACC), 5Universitary Clinic of Gynecology, Faculty of Medicine, University of Coimbra, 6Gynecology A Service, Coimbra Hospital and Universitary Center, 7Institute of Pharmacology & Experimental Therapeutics, Faculty of Medicine, University of Coimbra, 8Institute of Experimental Pathology, Faculty of Medicine, University of Coimbra, 9Cytometry Operational Management Unit, Clinical Pathology Service, Coimbra Hospital and Universitary Center, 10Polytechnic Institute of Coimbra, ESTESC-Coimbra Health School, Laboratory Biomedical Sciences
* These authors contributed equally

Summary

इस पद्धति का उद्देश्य कैंसर सेल लाइनों में कैंसर स्टेम सेल (सीएससी) और क्षेत्र बनाने प्रोटोकॉल के साथ प्राथमिक मानव ट्यूमर के नमूनों की पहचान करना है, एक मजबूत तरीके से, प्रवाह साइटोमेट्री और पश्चिमी के साथ कार्यात्मक परख और फेनोटाइपिक लक्षण वर्णन का उपयोग करना ब्लॉट.

Abstract

कैंसर स्टेम सेल (सीएससी) आत्म नवीकरण और प्लास्टिसिटी के साथ एक छोटी आबादी है जो ट्यूमर, उपचार के प्रतिरोध और आवर्ती रोग के लिए जिम्मेदार हैं । इस आबादी को सतह मार्कर, एंजाइमैटिक गतिविधि और एक कार्यात्मक प्रोफ़ाइल द्वारा पहचाना जा सकता है। फेनोटाइपिक विषमता और सीएससी प्लास्टिसिटी के कारण ये दृष्टिकोण सीमित हैं। यहां, हम स्तन और स्त्री रोग कैंसर से सीएससी क्षेत्रों को प्राप्त करने, कार्यात्मक गुणों, सीएससी मार्कर और प्रोटीन अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए क्षेत्र-निर्माण प्रोटोकॉल को अपडेट करते हैं। क्षेत्रों को निलंबन संस्कृति में कम घनत्व पर एकल-सेल सीडिंग के साथ प्राप्त किया जाता है, जो प्रवास और समुचित से बचने के लिए अर्ध-ठोस मिथाइलसेल्यूलोज माध्यम का उपयोग करते हैं। इस लाभदायक प्रोटोकॉल कैंसर सेल लाइनों में इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह भी प्राथमिक ट्यूमर में । त्रिआयामी गैर-अनुयायी निलंबन संस्कृति ने ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट, विशेष रूप से सीएससी-आला की नकल करने के लिए सोचा, सीएससी सिग्नलिंग सुनिश्चित करने के लिए एपिडर्मल विकास कारक और बुनियादी फाइब्रोब्लास्ट विकास कारक के साथ पूरक है। सीएससी की मजबूत पहचान के लिए लक्ष्य, हम कार्यात्मक और फेनोटाइपिक मूल्यांकन के संयोजन, एक पूरक दृष्टिकोण का प्रस्ताव करते हैं। क्षेत्र बनाने की क्षमता, आत्म नवीकरण और क्षेत्र प्रक्षेपण क्षेत्र सीएससी कार्यात्मक गुणों की स्थापना करता है। इसके अतिरिक्त, लक्षण वर्णन मार्कर के प्रवाह साइटोमेट्री मूल्यांकन शामिल है, CD44+/CD24 द्वाराप्रतिनिधित्व-और CD133, और पश्चिमी दाग, ALDH पर विचार । प्रस्तुत प्रोटोकॉल को प्राथमिक ट्यूमर नमूनों के लिए भी अनुकूलित किया गया था, एक नमूना पाचन प्रक्रिया के बाद, अनुवाद अनुसंधान के लिए उपयोगी है।

Introduction

कैंसर की आबादी विषम हैं, कोशिकाओं के साथ विभिन्न रूपात्मकता, प्रसार और आक्रमण क्षमता पेश, अंतर जीन अभिव्यक्ति के कारण । इन कोशिकाओं में, एक अल्पसंख्यक आबादी कैंसर स्टेम सेल (सीएससी)1नाम मौजूद है, जिसमें आत्म-नवीकरण की क्षमता है, प्राथमिक ट्यूमर आला की विषमता को फिर से तैयार करना और असाधारण रूप से विभेदक पैदा करना जो होम्योपैथिक नियंत्रण2को पर्याप्त रूप से प्रतिक्रिया नहीं देते हैं। सीएससी गुणों को सीधे नैदानिक अभ्यास में अनुवादित किया जा सकता है, घटनाओं के साथ सहयोग को देखते हुए, जैसे ट्यूमरयाट्रिकिटी या कीमोथेरेपी3के प्रतिरोध। सीएससी की पहचान लक्षित उपचारों के विकास का कारण बन सकती है जिसमें सतह मार्कर की रुकावट, सीएससी भेदभाव को बढ़ावा देना, सीएससी सिग्नलिंग पाथवे घटकों को अवरुद्ध करना, आला विनाश और एपिजेनेटिक तंत्रशामिलहो सकते हैं।

सीएससी का अलगाव कोशिकाओं की रेखाओं में और प्राथमिक ट्यूमर5,6,7,8के नमूनों में किया गया है । सीएससी के लिए वर्णित कार्यात्मक प्रोफ़ाइल में क्लोनोजेनिक क्षमता, साइड पॉपुलैरिटी और ट्यूमरोस्फीयर फॉर्मेशन9शामिल हैं। CD44उच्च/CD24कम फेनोटाइप लगातार स्तन सीएससी के साथ जुड़ा हुआ है, जो वीवो में ट्यूमरीजेनिक साबित हुआ है और पहले से ही मेसेनचिमल संक्रमण5,10के लिए एपिथेलियल के साथ जुड़ा हुआ है । उच्च ALDH गतिविधि भी स्टेमनेस और उपापिथेलियल से मेसेनचिमल संक्रमण (EMT) के लिए कई प्रकार के ठोस ट्यूमर11में जुड़ा हुआ है । एएलडीएच अभिव्यक्ति कीमोथेरेपी के प्रतिरोध और सीएससी फेनोटाइप इन विट्रो12, 13,14,15,16से जुड़ी हुई है . कई अन्य मार्कर को विभिन्न प्रकार के ट्यूमर में सीएससी गुणों से जोड़ा गया है, जैसे CD133, CD49f, ITGA6, CD1663,4 और अन्य, जैसा कि तालिका 1में वर्णित है।

ट्यूमर स्फीयर में सीएससी के अध्ययन और विस्तार के लिए एक त्रि-आयामी मॉडल शामिल है। इस मॉडल में, सेल लाइनों से और रक्त या ट्यूमर के नमूनों से सेल निलंबन की खेती विकास कारकों के साथ पूरक माध्यम में की जाती है, अर्थात् एपिडर्मल विकास कारक (ईजीएफ) और बुनियादी फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर (बीएफजीएफएफ), भ्रूण बोवाइन सीरम के बिना और गैर-अनुयायी स्थितियों में17। कोशिका आसंजन के अवरोध के परिणामस्वरूप विभेदित कोशिकाओं की एनोसिकिस से मृत्यु हो जातीहै । गोले एक अलग कोशिका के क्लोनल विकास से प्राप्त होते हैं। इस उद्देश्य के लिए, कोशिकाओं को कम घनत्व पर वितरित किया जाता है ताकि सेल संलयन और एकत्रीकरण19से बचा जा सके। एक अन्य रणनीति में सेमीसॉलिड मिथाइलसेल्यूलोस20का उपयोग शामिल है ।

क्षेत्र बनाने प्रोटोकॉल समय और लागत और तकनीकी, लाभदायक, और प्रजनन कारणों से सीएससी अलगाव और विस्तार में लोकप्रियता प्राप्तकी 21,22। किस हद तक क्षेत्र गठन सीएससी को दर्शाता है पर कुछ भंडारों के बावजूद, विशेषता फेनोटाइप के साथ गैर-अनुयायी परिस्थितियों में बढ़ने के लिए स्टेम कोशिकाओं की प्रवृत्ति है, जो देशी माइक्रोएनवायरमेंट21जैसा दिखता है। ठोस ट्यूमर से सीएससी के अलगाव के लिए उपलब्ध तरीकों में से कोई भी पूरी दक्षता नहीं है, जो अधिक विशिष्ट मार्कर या पद्धतियों और मार्कर के संयोजन ों को विकसित करने के महत्व को रेखांकित करता है।

इस प्रोटोकॉल में, हम गैर-अनुयायी स्थितियों में एकल-कोशिका वृद्धि के सिद्धांत और विभेदित फेनोटाइप का उत्पादन करने की क्षमता के साथ, क्षेत्र-निर्माण प्रोटोकॉल के साथ सीएससी के अलगाव का विस्तार करते हैं। इस प्रक्रिया का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व चित्र 1में दर्शाया गया है । हम स्तन और स्त्री रोग ट्यूमर कोशिकाओं और प्राथमिक ट्यूमर के नमूनों दोनों के लिए सीएससी के लिए सतह मार्कर और एएलडीएच अभिव्यक्ति के साथ लक्षण वर्णन का भी वर्णन करते हैं।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल कोइम्ब्रा अस्पताल और यूनीवर्सिटरी सेंटर (CHUC) ट्यूमर बैंक के नैतिक दिशा निर्देशों का पालन किया गया था, और स्वास्थ्य के लिए है CHUC नैतिकता समिति और पुर्तगाली राष्ट्रीय डेटा संरक्षण आयोग द्वारा अनुमोदित किया गया था ।

1. सतत सेल संस्कृतियों से क्षेत्र बनाने प्रोटोकॉल और व्युत्पन्न अनुयायी आबादी

नोट: सख्त बाँझ शर्तों के तहत सभी प्रक्रियाओं का प्रदर्शन करें।

  1. गैर-अनुयायी निलंबन संस्कृति की तैयारी पॉली (2-हाइड्रोक्सेथिल-मेथेक्रिलेट (पॉली-हेमा) के साथ विकास की सतह को कोटिंग करके फ्लैक्स या प्लेटें
    1. 65 डिग्री सेल्सियस पर पूर्ण इथेनॉल में पॉली-हेमा को हिलाकर 15 मिलीग्राम/मीटर समाधान तैयार करें। कोट सेल संस्कृति ५० μL/सेमी2के साथ फ्लास्क या प्लेटें ।
    2. सुखाने वाले ओवन में 37 डिग्री सेल्सियस पर सूखने के लिए छोड़ दें। यदि आवश्यक हो, तो प्लेटों को लपेटें और कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
  2. गोला की तैयारी मीडिया (सीएम)
    1. अल्ट्राप्योर पानी में मिथाइलसेल्यूलोज का 2% समाधान तैयार करें और ऑटोक्लेव में स्टरलाइज करें। मिथाइलसेल्यूलोस ठंडा होने से घुलना आसान हो जाता है; इसलिए 80 डिग्री सेल्सियस पर पानी में पाउडर तितर बितर और23ठंडा जब तक हलचल .
    2. सीएम (स्टॉक सॉल्यूशन) का दो बार केंद्रित समाधान तैयार करें। सीएम वर्किंग सॉल्यूशन में डीएमईएम-एफ12 होता है, जो 100 एमएम पुत्रस्सिन, 1% इंसुलिन, ट्रांसफरिन, सेलेनियम और 1% एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक सॉल्यूशन (10,000 यू/एमएल पेनिसिलिन, 10 मिलीग्राम/एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन और 25 μg/mL एम्फोटेरिसिन बी) के साथ पूरक है।
    3. सीएम तैयार करने के लिए, मिथाइलसेल्यूलोज के 2% समाधान के साथ सीएम स्टॉक समाधान के बराबर वॉल्यूम मिलाएं।
    4. 10 एनजी/एमएल एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईएफजी) और 10 एनजी/एमएल बेसिक फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर (बीएफजीएफ) जोड़कर इस्तेमाल करने से तुरंत पहले मीडियम को पूरा करें ।
    5. यदि अधिक दुराग्रही सेल लाइनें उपयोग में हैं, तो 0.4% गोजातीय सीरम एल्बुमिन के साथ माध्यम को पूरक करें, जो एक लाभ हो सकता है।
  3. 80% से 90% संगम के साथ MCF7 या HCC1806 स्तन कैंसर या ईसीसी-1 या RL95-2 एंडोमेट्रियल कैंसर कोशिकाओं (या पसंद की अन्य कैंसर सेल लाइन) के एक फ्लास्क के साथ शुरू करें।
  4. सेल कल्चर मीडिया को त्यागें, फॉस्फेट बफर्ड लवलाइन सॉल्यूशन (पीबीएस) से धोएं और कॉल्स िन-ईडीटीए (75 सेमी2 सेल कल्चर फ्लास्क के लिए 1 से 2 मिलील) के साथ कोशिकाओं को अलग करें।
  5. कोशिका संस्कृति मीडिया जोड़ें (एक 75 सेमी2 सेल संस्कृति फ्लास्क के लिए 2 से 4 मिलीएल) और एंजाइमों को त्यागने के लिए 5 मिन के लिए 200 x ग्राम पर अपकेंद्री।
  6. एक ही सेल निलंबन सुनिश्चित करने के लिए सेल संस्कृति मीडिया की एक ज्ञात मात्रा में गोली को निलंबित करें और ऊपर और नीचे पिपेट करें। इसके लिए 40 माइक्रोन सेल छलनी का इस्तेमाल किया जा सकता है।
  7. कोशिकाओं को हीमोसाइटोमीटर में गिनें और सेल निलंबन की कोशिका एकाग्रता की गणना करें। एकल सेल निलंबन की टिप्पणी सुनिश्चित करने के लिए इस कदम का लाभ उठाएं। उपचार के प्रभावों को सही ढंग से निर्धारित करने के लिए सावधान सेल गिनती आवश्यक है।
  8. सीएम पूर्ण माध्यम में सेल निलंबन की निर्धारित राशि को निलंबित करें और पॉली-हेमा कोटेड व्यंजनों में स्थानांतरित करें। सीडिंग घनत्व के लिए एक संदर्भ मूल्य के रूप में, ५०० से २००० कोशिकाओं/सेमी2पर विचार करें ।
    नोट: सीडिंग घनत्व का अनुकूलन और प्रत्येक सेल लाइन के लिए संस्कृति का समय अत्यधिक अनुशंसित है24।
  9. प्लेटों को परेशान किए बिना 2 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें।
  10. सेल कल्चर मीडिया में 10 एनजी/एमएल ईएफजी और 10 एनजी/एमएल बीएफजीएफएफ जोड़कर विकास कारकों की एकाग्रता को फिर से स्थापित करें । हर दो दिन में इस स्टेप को दोहराएं।
  11. चढ़ाना के 5 दिन बाद तक 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट (यह सेल लाइन के अनुसार 3 से 12 दिनों तक भिन्न हो सकता है) क्षेत्रों को प्राप्त करने के लिए, जो निलंबन गेंद के आकार की सेल उपनिवेशों की आकृति विज्ञान पेश करते हैं।
  12. प्रयोगों के लिए पाइपिंग करके, क्षेत्रों का उपयोग करें या एकत्र करें।
  13. व्युत्पन्न अनुयायी आबादी प्राप्त करने के लिए, उपयोग की जाने वाली सेल लाइन से संबंधित क्षेत्रों को मानक संस्कृति स्थितियों में रखें। 1 से 2 दिन बाद, अनुयायी क्षेत्रों के आसपास बढ़ने वाली कोशिकाओं के मोनोलेयर का निरीक्षण करना संभव है, जो मूल की कोशिका रेखा के समान एक आकृति विज्ञान प्रस्तुत करता है।

2. मानव ट्यूमर के नमूनों से क्षेत्र बनाने प्रोटोकॉल

नोट: अनुसंधान प्रयोजनों के लिए मानव नमूनों का उपयोग प्रत्येक देश के कानून का पालन करना चाहिए, और शामिल संस्थानों की नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया जाना चाहिए ।

  1. डीएमईएम/F12 युक्त परिवहन मीडिया तैयार करें, जो 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 2% एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक सॉल्यूशन (10,000 यू/एमएल पेनिसिलिन, 10 मिलीग्राम/एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन और 25 μg/mL एम्फोटेरिमेंबी बी) के साथ पूरक है।
  2. डीएमईएम/एफ12 युक्त पाचन मीडिया तैयार करें, जो 10% एफबीएस, 1% एंटीबायोटिक एंटीमाइकोटिक सॉल्यूशन, 1 एमजी/एमएल टाइप IV कोलेजेनेज और १०० μg/mL DNAse I के साथ पूरक है ।
  3. डीएमईएम/एफ12 युक्त एंजाइम इनएक्टिवेशन मीडिया तैयार करें, जो 10% एफबीएस और 1% एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक सॉल्यूशन (10,000 यू/एमएल पेनिसिलिन, 10 मिलीग्राम/एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन और 25 μg/mL एम्फोटेरिसिन बी) के साथ पूरक है ।
  4. धारा 1.2 में वर्णित सीएम तैयार करें।
  5. सर्जिकल हटाने के बाद जितनी जल्दी हो सके ऑपरेटिव टुकड़ा के स्थूल अध्ययन के दौरान नमूना प्राप्त करें।
  6. नमूनों को परिवहन मीडिया में रखें और उन्हें जहां प्रसंस्करण के लिए प्रयोगशाला में स्थानांतरित करें। प्रक्रिया की सफलता दर में सुधार करने के लिए संग्रह के बाद 1 घंटे के भीतर नमूना प्रसंस्करण शुरू होना चाहिए। नमूना संग्रह में सावधानी बरतें। नमूनों को सावधानी से संभालें। परिगलित या कौटरीकृत क्षेत्रों के उपयोग से बचें।
  7. बाँझ प्रवाह कक्ष के नीचे, नमूने को एक डिश में स्थानांतरित करें और स्केलपेल के साथ छोटे टुकड़ों (लगभग 1 मिमी3)में काट लें।
  8. पाचन मीडिया के साथ एक ट्यूब में मानव ऊतक को 180 मिन तक घुमाने वाले शेकर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। ट्यूब ए के रूप में इस ट्यूब की पहचान करें।
  9. हर 15 मिन एंजाइम समाधान को बदलें।
    1. पाचन मीडिया (किसी भी ऊतक के टुकड़े को हटाने के बिना) ले लीजिए और एंजाइम निष्क्रियता मीडिया से भरा एक नया ट्यूब आधा करने के लिए एक ४० μm सेल छलनी के माध्यम से हस्तांतरण । कमरे के तापमान पर इस ट्यूब को बनाए रखें और ट्यूब बी के रूप में इसकी पहचान करें।
    2. ट्यूब ए में नया पाचन मीडिया जोड़ें और इसे 37 डिग्री सेल्सियस पर घूर्णन शेखर को वापस करें।
    3. प्रत्येक संग्रह में, ट्राइपैन ब्लू अपवर्जन विधि का उपयोग करके सेल व्यवहार्यता की जांच करें।
    4. 180 मिन के लिए या जब तक सेल गिनती काफी कम है के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं।
  10. ट्यूब ए में ऊतक के टुकड़ों को एक दूसरे पाचन समाधान में इनक्यूबेट करें जिसमें एक्क्यूटेज और ट्राइप्सिन-ईटीए के बराबर हिस्से होते हैं, जो 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 सीन के लिए सरगर्मी करते हैं।
  11. ट्यूब ए में एंजाइम निष्क्रियता मीडिया जोड़ें और ट्यूब बी में एक ४० μm सेल छलनी के माध्यम से सामग्री फिल्टर ।
  12. 10 00 x ग्राम पर ट्यूब बी में सेल निलंबन को सेंट्रलाइज करें।
  13. सीएम में गोली को निलंबित करें और हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके सेल एकाग्रता की जांच करें।
  14. सीएम में सेल निलंबन की निर्धारित राशि को निलंबित करें और 4000 कोशिकाओं/सेमी2के सीडिंग घनत्व के साथ पॉली-हेमा कोटेड व्यंजन (चरण 1.1 देखें) में स्थानांतरित करें।
  15. प्लेटों को परेशान किए बिना 2 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें।
  16. सेल कल्चर मीडिया में 10 एनजी/एमएल ईएफजी और 10 एनजी/एमएल बीएफजीएफएफ जोड़कर विकास कारकों की एकाग्रता को फिर से स्थापित करें ।
    नोट: आपको हर दो दिन में ऐसा करना चाहिए।
  17. चढ़ाना के 5 दिन बाद तक 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट (यह 12 दिनों तक भिन्न हो सकता है) क्षेत्रों को प्राप्त करने के लिए, जो निलंबन गेंद के आकार की सेल उपनिवेशों की आकृति विज्ञान पेश करते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: मानव एंडोमेट्रियल ट्यूमर के नमूनों (ए) और स्तन और स्त्री रोग कैंसर सेल लाइनों (बी) से कैंसर स्टेम कोशिकाओं को प्राप्त करना। मानव ट्यूमर के नमूने खंडित, एंजाइमैटिक रूप से पचाते हैं और पाली-हेमा कोटेड व्यंजनों में मध्यम रूप से क्षेत्र में चढ़ाया जाता है। कैंसर सेल लाइनों अलग कर रहे हैं, सेल निलंबन गिना जाता है, और एकल कोशिकाओं को उचित परिस्थितियों में पाली-हेमा लेपित प्लेटों में कम घनत्व पर वितरित कर रहे हैं । प्राप्त क्षेत्रों, जब अनुयायी संस्कृति की स्थिति के तहत रखा, व्युत्पन्न अनुयायी आबादी का उत्पादन । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

3. क्षेत्र बनाने की क्षमता, आत्म नवीकरण, और क्षेत्र प्रक्षेपण क्षेत्र

नोट: क्षेत्र बनाने की क्षमता एक ट्यूमर सेल आबादी के क्षेत्रों का उत्पादन करने की क्षमता है । आत्म नवीकरण क्षेत्र कोशिकाओं की क्षमता को निलंबन में गोलाकार कोशिकाओं की नई कालोनियों का उत्पादन है । क्षेत्र प्रक्षेपण क्षेत्र क्षेत्र द्वारा कब्जा कर लिया क्षेत्र का प्रतिनिधि है और इसलिए उनके आकार और एक निश्चित समय अवधि में आया सेल डिवीजनों की संख्या का अर्थपूर्ण है ।

  1. क्षेत्र बनाने की क्षमता का निर्धारण
    1. गोला बनाने प्रोटोकॉल पूरा होने के बाद, 5 मिन के लिए 125 x ग्राम पर एक अपकेंद्रित्र ट्यूब और अपकेंद्रित्र में क्षेत्रों को इकट्ठा करें।
    2. सीएम को त्यागें और ताजा मीडिया की ज्ञात मात्रा में गोली को धीरे से निलंबित करें। गिनती की सुविधा के लिए क्षेत्रों को केंद्रित करने के उद्देश्य से, एक छोटे से मीडिया की मात्रा में क्षेत्रों को निलंबित करें। क्षेत्रों में परेशानन न हो इसका ध्यान रखें।
    3. व्यास में 40 माइक्रोन से अधिक के साथ क्षेत्रों की गिनती करने के लिए एक हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करें। वैकल्पिक रूप से, एक ग्रैटिकुले25 से सुसज्जित माइक्रोस्कोप का उपयोग करके या स्वचालित प्रणाली26,27का उपयोग करके सीधे प्लेट पर गोले गिने जा सकते हैं।
    4. शुरू में चढ़ाया कोशिकाओं की संख्या बनाम प्राप्त क्षेत्रों के प्रतिशत अनुपात की गणना करें ।
  2. आत्म-नवीकरण का निर्धारण
    1. गोला बनाने प्रोटोकॉल पूरा होने के बाद, 5 मिन के लिए 125 x ग्राम पर एक अपकेंद्रित्र ट्यूब और अपकेंद्रित्र में क्षेत्रों को इकट्ठा करें।
    2. गोला को मीडिया को त्यागें और ट्राइप्सिन-ईडीटीए में गोली को धीरे से निलंबित करें।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन तक इनक्यूबेट करें।
    4. एंजाइम निष्क्रियता मीडिया जोड़ें और एक ही सेल निलंबन सुनिश्चित करने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट करें।
    5. हीमोसाइटोमीटर और ट्राइपैन ब्लू अपवर्जन विधि का उपयोग करके, निलंबन में व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना करें।
    6. धारा 1 में वर्णित क्षेत्र बनाने प्रोटोकॉल शुरू करें।
    7. 8 दिनों के बाद, व्यास में 40 माइक्रोन से अधिक क्षेत्रों की गिनती करने के लिए हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करें।
    8. शुरू में चढ़ाया कोशिकाओं की संख्या बनाम प्राप्त क्षेत्रों के प्रतिशत अनुपात की गणना करें ।
  3. क्षेत्र प्रक्षेपण क्षेत्र का निर्धारण
    1. क्षेत्रों द्वारा कब्जा कर लिया क्षेत्र का मूल्यांकन करने के लिए, एक छवि अधिग्रहण मॉड्यूल से लैस एक उल्टे माइक्रोस्कोप में प्रति शर्त कम से कम 10 यादृच्छिक क्षेत्रों की छवियां प्राप्त करें। 100X से 400X तक आवर्धन की सिफारिश की जाती है।
    2. इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करछवियों का विश्लेषण करें, जैसे इमेजजे सॉफ्टवेयर28,क्षेत्रों के अनुरूप ब्याज के क्षेत्रों को ड्राइंग करके और पिक्सेल में इसके क्षेत्र को मापने के द्वारा।
    3. मापा पिक्सल के मतलब क्षेत्र के रूप में क्षेत्र प्रक्षेपण क्षेत्र की गणना करें।

4. फ्लो साइटोमेट्री के साथ कैंसर स्टेम सेल मार्कर मूल्यांकन

नोट: CD44+/CD24-/कम फेनोटाइप लगातार स्तन और स्त्री रोग कैंसर स्टेम कोशिकाओं के साथ जुड़ा हुआ था । वर्णित प्रक्रिया का उपयोग इस और अन्य सेल सतह मार्कर का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है।

  1. गोला बनाने प्रोटोकॉल पूरा होने के बाद, 5 मिन के लिए 125 x ग्राम पर एक अपकेंद्रित्र ट्यूब और अपकेंद्रित्र में क्षेत्रों को इकट्ठा करें।
  2. सीएम को त्यागें और ट्राइप्सिन-ईटीए में गोली को धीरे से निलंबित करें।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन तक इनक्यूबेट करें।
  4. एंजाइम निष्क्रियता मीडिया जोड़ें और एक ही सेल निलंबन सुनिश्चित करने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट करें।
  5. 5 मिन के लिए 125 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र, अधिनेत त्यागें और धीरे से पीबीएस में कोशिकाओं को निलंबित करें।
  6. कोशिकाओं को झिल्ली संरचना की वसूली सुनिश्चित करने के लिए 30 मिन के लिए निलंबन में आराम करने की अनुमति दें।
  7. हीमोसाइटोमीटर और ट्राइपैन ब्लू अपवर्जन विधि का उपयोग करके, निलंबन में कोशिकाओं की गणना करें।
  8. सेल सस्पेंशन वॉल्यूम को 106 कोशिकाओं/500 माइक्रोन में समायोजित करें।
  9. आपूर्तिकर्ताओं (एकाग्रता, समय, तापमान और प्रकाश/अंधेरे) के निर्देशों के अनुसार मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट और टेबल 2 में प्रतिनिधित्व किए गए प्रयोग सेट या टेबल 1में दिए गए मार्कर पर विचार करना।
  10. धुंधला करने के तुरंत बाद, उचित पता लगाने मॉड्यूल के साथ एक प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग करप्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण करें।
  11. यूरोफ्लो कंसोर्टियम29द्वारा स्थापित प्रोटोकॉल का पालन करते हुए साइटोमीटर सेटअप का मानकीकरण करें।
  12. मलबे और मृत कोशिकाओं को छोड़कर आगे और साइड स्कैटर के आधार पर प्राथमिक द्वार स्थापित करें। इसे एनेक्सिन वी और गेटिंग निगेटिव कोशिकाओं के साथ सहवर्ती लेबलिंग से सुधारा जा सकता है ।
  13. एक दाग नियंत्रण का उपयोग कर एक स्पेक्ट्रल ओवरलैप के लिए अरंजित नमूनों और मुआवजे के आधार पर फ्लोरेसेंस गेट्स सेट करें।

5. वेस्टर्न ब्लॉट के साथ कैंसर स्टेम सेल मार्कर मूल्यांकन

नोट: ALDH1 गतिविधि के अलावा, इस मार्कर की उच्च अभिव्यक्ति लगातार स्तन और स्त्री रोग कैंसर स्टेम सेल13,14के साथ जुड़ा हुआ था । वर्णित प्रक्रिया का उपयोग इस और अन्य सेल मार्कर का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है।

  1. गोला बनाने प्रोटोकॉल पूरा होने के बाद, 5 मिन के लिए 125 x ग्राम पर एक अपकेंद्रित्र ट्यूब और अपकेंद्रित्र में क्षेत्रों को इकट्ठा करें।
  2. पूरे सेल की तैयारी
    1. अपकेंद्रित्र ट्यूबों को बर्फ पर रखें और पैलेट को बाधित किए बिना अधिनायक को त्याग दें।
    2. पैलेट को ठंडे पीबीएस के 1 मिलील से धोएं और सेंट्रलाइज्ड द्वारा त्यागें।
    3. रिपा लिसिस बफर30 (NaCl 150 mM) की एक छोटी मात्रा (200-500 μL) में गोली को निलंबित करें, Tris-HCl १.५० mM पीएच ७.४, ट्राइटन-X100 1% vol./vol., सोडियम deoxycholic एसिड ०.५% wt./vol., सोडियम dodecyl सल्फेट ०.५% wt./vol.) cOmplete मिनी और dithiothreitol 1 mM के साथ पूरक ।
    4. नमूनों को ठंडा बनाए रखना (बर्फ पर), उन्हें 30% आयाम के साथ भंवर और ध्वनिकरण के लिए प्रस्तुत करें।
    5. सेंट्रलाइज 15 मिन के लिए 15 मिन के लिए 14,000 x ग्राम में एक रेफ्रिजरेटेड अपकेंद्रित्र सेट में 4 डिग्री सेल्सियस सेट ।
    6. सुपरनेट्स को नए, ठीक से पहचाने गए माइक्रोट्यूब में स्थानांतरित करें।
    7. बीसीए या ब्रैडफोर्ड परख31का उपयोग कर प्रोटीन सांद्रता निर्धारित करें ।
    8. यदि आवश्यक हो, तो नमूनों को आगे पश्चिमी दाग विश्लेषण तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. मानक पश्चिमी ब्लॉटिंग प्रोटोकॉल के अनुसार नमूना डेनाटुरिशन, इलेक्ट्रोफोरेसिस, इलेक्ट्रॉन ट्रांसफर और प्रोटीन डिटेक्शन करें, जैसा कि32,33,34वर्णित है।

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Representative Results

क्षेत्र बनाने प्रोटोकॉल गोलाकार कालोनियों को कई एंडोमेट्रियल और स्तन कैंसर सेल लाइनों(चित्रा 2ए)या मानव ट्यूमर नमूनों से ऊतक के कोमल एंजाइमैटिक पाचन के बाद निलंबन में प्राप्त करने की अनुमति देता है(चित्रा 2ई)। दोनों ही मामलों में, चढ़ाना के कुछ दिनों बाद, निलंबन में मोनोक्लोनल गोलाकार कॉलोनियां प्राप्त की जाती हैं। एंडोमेट्रियल और स्तन कैंसर दोनों क्षेत्र मूल की कोशिका रेखा के समान आकृति विज्ञान के साथ एक सेल मोनोलेयर को जन्म देते हैं, चढ़ाना के 1 से 2 दिन बाद(चित्रा 2ए)।

अलग वंश और ऊतक मूल क्षेत्र बनाने की क्षमता, आत्म नवीकरण और प्रक्षेपण क्षेत्र से तुलना की जा सकती है । स्तन कैंसर सेल लाइनों से प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 2बी-डीमें रेखांकन में देखा जा सकता है । हार्मोनल रिसेप्टर-पॉजिटिव ब्रेस्ट कैंसर MCF7 कोशिकाओं को उच्च क्षेत्र बनाने की क्षमता, आत्म नवीकरण और प्रक्षेपण क्षेत्र ट्रिपल नकारात्मक स्तन कैंसर कोशिकाओं HCC180614से दिखाते हैं । दोनों सेल लाइनों के लिए, चढ़ाया कोशिकाओं का एक छोटा सा प्रतिशत (3%) ट्यूमर सेल विषमता के भीतर एक अल्पसंख्यक आबादी के रूप में कैंसर स्टेम कोशिकाओं पर जोर क्षेत्रों का उत्पादन करने में सक्षम था । कैंसर स्टेम सेल स्वयं नवीकरण क्षेत्र स्वयं के एक काफी अलग मूल्य द्वारा पेटेंट किया गया था सेल लाइनों का नवीकरण प्रतिनिधित्व किया । क्षेत्र प्रक्षेपण क्षेत्र, क्षेत्रों के आयाम के एक मोटा उपाय के रूप में, माइटोटिक चक्रकी संख्या के साथ संबंधित है और दोनों वंश के लिए अलग समय अंतराल प्रदर्शित करता है ।

जबकि कोशिकाओं का केवल एक छोटा सा अनुपात विट्रो में ट्यूमर स्गोले बनाने और स्टेम सेल गुणों को ले जाने वाली आत्म-नवीकरण क्षमता को बनाए रखने में सक्षम है, कई मार्कर इस फेनोटाइप से जुड़े थे।

प्रस्तुत प्रवाह साइटोमेट्री प्रोटोकॉल बहुमुखी प्रयोगात्मक दृष्टिकोणों के लिए अनुमति देता है, सतह एंटीजन पर विचार (तालिका 1देखें) । प्रतिनिधि परिणाम, चित्रा 3ए-बीमें दिखाया गया है, चिंता CD44/CD24 और CD133 झिल्ली मार्कर है कि एक और अधिक कैंसर स्टेम सेल की तरह phenotype के अनुरूप के रूप में प्रस्तावित किया गया है । एंडोमेट्रियल RL95-2 और ईसीसी-1 सेल लाइनों से प्राप्त क्षेत्रों के विश्लेषण से चार आबादी की पहचान की जा सकती है(चित्रा 3ए)। एंडोमेट्रियल RL95-2 से प्राप्त क्षेत्रों में एक सीडी44उच्च/CD24- जनसंख्या माता पिता की सेल लाइन35से तीन गुना बड़ा शामिल था। ईसीसी-1 क्षेत्रों के मामले में, सीडी44 उच्च/CD24-प्रमुख आबादी से मेल खाती है, जो CD133 सकारात्मक भी है, जबकि CD44कम/CD24-,CD44कम/CD24+ और CD44-/CD24 + नकारात्मक या कम CD133 अभिव्यक्ति है ।

कोमल क्षेत्र संचयन और सावधान प्रोटीन नमूना तैयारी के बाद सतह और इंट्रासेलुलर मार्कर का आकलन भी पश्चिमी दाग द्वारा किया जा सकता है। चित्रा 3सी ALDH परिवर्तन के विशिष्ट परिणाम दिखाता है, एक मार्कर जिसकी बढ़ी हुई गतिविधि या संवर्धित प्रोटीन अभिव्यक्ति कैंसर स्टेम सेल फेनोटाइप13,14 क्षेत्रों पर और मूल के एंडोमेट्रियल ECC1 सेल लाइन के बारे में व्युत्पन्न अनुयायियों के साथ जुड़ा हुआ है ।

Figure 2
चित्रा 2: एंडोमेट्रियल और स्तन कैंसर कोशिकाओं, क्षेत्रों और व्युत्पन्न अनुयायी आबादी। (A) . एंडोमेट्रियल (आरएल95-2 और ईसीसी-1) और स्तन (एमसीएफ7 और एचसीसी1806) कैंसर सेल लाइनों, संबंधित एंडोमेट्रियल (ES1) और स्तन (MS1) क्षेत्रों और व्युत्पन्न अनुयायी आबादी (जी1) की प्रतिनिधि छवियां। RL95-2, ECC-1, MCF7 और HCC1806 कैंसर सेल लाइनों के प्रतिनिधि छवियों को 200x (स्केल बार = 50 माइक्रोन) के आवर्धन पर प्राप्त किया गया था। ES1 RL95-2 और ES1 ECC-1 के प्रतिनिधि छवियों को 200x (स्केल बार = 50 माइक्रोन) के आवर्धन में प्राप्त किया गया था। MS1 MCF7 और MS1 HCC1806 के प्रतिनिधि छवियों को 200x (स्केल बार = 100 माइक्रोन) के आवर्धन में प्राप्त किया गया था। G1 RL95-2 और G1 ECC-1 के प्रतिनिधि छवियों को 200x (स्केल बार = 50 माइक्रोन) के आवर्धन में प्राप्त किया गया था। G1 MCF7 और G1 HCC1806 के प्रतिनिधि छवियों को 200x (स्केल बार = 100 माइक्रोन) के आवर्धन में प्राप्त किया गया था। (बी-डी) . स्तन कैंसर क्षेत्रों MCF7 और HCC1806 के क्षेत्र निर्माण क्षमता, आत्म नवीकरण और क्षेत्र प्रक्षेपण क्षेत्र । (ई) . मानव एंडोमेट्रियल ट्यूमर के नमूनों से प्राप्त क्षेत्रों की प्रतिनिधि छवियां। इन छवियों को 200x (स्केल बार = 50 माइक्रोन) के आवर्धन पर कब्जा कर लिया गया था। इस आंकड़े का एक हिस्सा प्रकाशक14से अनुमति के साथ पिछले प्रकाशन से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: एंडोमेट्रियल कैंसर कोशिकाओं में कैंसर स्टेम कोशिकाओं मार्कर का संयुक्त मूल्यांकन । (A) . RL95-2 सेल लाइन और RL95-2 क्षेत्र कोशिकाओं के CD44/CD24 लेबलिंग के प्रतिनिधि भूखंड । (ख) . RL95-2 और ECC-1 सेल लाइनों से प्राप्त क्षेत्र कोशिकाओं (ES1) की CD133 लेबलिंग के प्रतिनिधि हिस्टोग्राम । घनत्व कोशिका गिनती के एक उपाय का प्रतिनिधित्व करता है। CD44+/CD24-, CD44कम/CD24-CD44-C44-/CD24+ आबादी क्रमशः हरे, गुलाबी, नीले और पीले रंग में चित्रित कर रहे हैं । ईसीसी-1 सेल लाइन, क्षेत्रों (ES1) में सी एएलडीएच अभिव्यक्ति, और व्युत्पन्न अनुयायी आबादी (जी1)। इम्यूनोब्लॉट संबंधित प्रायोगिक स्थितियों के लिए एएलडीएच और ऐक्टिन अभिव्यक्ति का प्रतिनिधित्व करता है। ALDH अभिव्यक्ति एंटीबॉडी ALDH1/2 है, जो आइसोफॉर्म ALDH1A1, ALDH1A2, ALDH1A3 और माउस, चूहा और मानव मूल के ALDH2 का पता लगाता है के साथ मूल्यांकन किया गया था । इस आंकड़े का एक हिस्सा प्रकाशकों की अनुमति के साथ पिछले प्रकाशनों से संशोधित किया गया है13. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

तालिका 1: स्त्री रोग और स्तन कैंसर स्टेम सेल मार्कर की सूची।

मार्कर स्टेम सेल मूल संदर्भ
सीडी24 ओवेरियन कैंसर 60
सीडी29 स्तन कैंसर 61
सीडी44 ओवेरियन कैंसर 62,63
CD44/CD24-/कम स्तन कैंसर 13,5,3,64
CD44+/CD24/low/ESA स्तन कैंसर 65
CD44/ALDH1+/हाय स्तन कैंसर 66
CD44/CD24-/low/ABCG2 स्तन कैंसर 67
CD44/CD24-/कम/ALDH1 स्तन कैंसर 43,68,69
CD44/CD24-/कम/EpCAM स्तन कैंसर 5
CD44/CD24-/low/SSEA-3 स्तन कैंसर 70
CD44/CD49f/CD133/2 स्तन कैंसर 71
CD44/CD133/ALDH1+/hi स्तन कैंसर 69
सीडी44/सीडी117 ओवेरियन कैंसर 7
CD44/MyD88 ओवेरियन कैंसर 72,73
CD44/ई-cadherin-/CD34- ओवेरियन कैंसर 74,75
CD44/CD24/Epcam ओवेरियन कैंसर 76,77
सीडी44/सीडी24- ओवेरियन कैंसर 78,79
सीडी44/सीडी166 ओवेरियन कैंसर 80
सीडी44/सीडी24 सर्वाइकल कैंसर 81
CD49f स्तन कैंसर 4
सर्वाइकल कैंसर 82
CD117 या सी-किट एंडोमेट्रियल कैंसर 83
ओवेरियन कैंसर 62,84
सीडी133 स्तन कैंसर 4,85
ओवेरियन कैंसर 62,86
एंडोमेट्रियल कैंसर 13,87,88,89
सर्वाइकल कैंसर 82
CD133 हाय/CXCR4हाय/ALDH1हाय स्तन कैंसर 90
CD133/ALDH1 स्तन कैंसर 91
ओवेरियन कैंसर 60,92
CD133/CXCR4 एंडोमेट्रियल कैंसर 93
ABCG2 स्तन कैंसर 65
सर्वाइकल कैंसर 82,81
एएलडीएच-1 स्तन कैंसर 4
एंडोमेट्रियल कैंसर 94,95
सर्वाइकल कैंसर 82
CXCR4 या CD184 स्तन कैंसर 96
EpCAM/CD49f स्तन कैंसर 97
EpCAMहाय/PROCR हाय/SSEA-3 स्तन कैंसर 70
GD2/GD3/GD3Sहाय स्तन कैंसर 98
ITGA6 स्तन कैंसर 4
प्रोसीआर स्तन कैंसर 43

नोट: यह तालिका विभिन्न स्त्री रोगों और स्तन कैंसर स्टेम कोशिकाओं द्वारा व्यक्त सतह एपिटोप की एक सूची प्रदान करती है; इनमें से अधिकांश मार्कर अन्य ऊतकों की एक श्रृंखला द्वारा भी व्यक्त किए जाते हैं। इस सूची में रिपोर्ट किए गए सभी मार्कर को शामिल करने का लक्ष्य नहीं है।

तालिका 2: CD24/CD44 फेनोटाइप का मूल्यांकन करने के लिए एक विशिष्ट प्रवाह साइटोमेट्री प्रयोग में शामिल किए जाने वाले ट्यूबों की सूची। तालिका आवश्यक नियंत्रणों सहित सह-धुंधला प्रयोग के लिए आवश्यक नमूना ट्यूबों का एक न्यूनतम सेट दिखाती है।

ट्यूब हालत एंटीजन-फ्लोरोफोर
1 अनदाग कोशिकाएं कोई नहीं
2 एकल दाग सीडी44 सीडी44-पीई
3 एकल दाग सीडी 24 सीडी24-एपीसी
4 डबल दाग CD44/CD24 सीडी44-पीई और सीडी24-एपीसी

नोट: इस प्रयोग को एनेक्सिन वी-एफसीटी को ट्यूब 4 में जोड़कर और एनेक्सिन वी नकारात्मक कोशिकाओं को गेट करने और एपोप्टोसिस में अंतिम कोशिकाओं को बाहर करने के लिए संबंधित नियंत्रण ट्यूब जोड़ने के लिए किया जा सकता है।

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Discussion

यह प्रोटोकॉल कैंसर सेल लाइनों और प्राथमिक मानव नमूनों से ट्यूमर स्फीयर प्राप्त करने के लिए एक दृष्टिकोण का विवरण देता है। ट्यूमर स्फीयर स्टेम सेल जैसे गुणों36के साथ एक उप-आबादी में समृद्ध होते हैं। सीएससी में यह संवर्धन एंकरेज-मुक्त वातावरण में व्यवहार्यता पर निर्भर है जबकि विभेदित कोशिकाएं एक सब्सट्रेट37के आसंजन पर निर्भर हैं। निलंबन लागू करने वाले कम पालन वातावरण में ट्यूमर कोशिकाओं की प्राथमिक चढ़ाना सीएससी में संवर्धन सुनिश्चित नहीं करता है, इसलिए हम आत्म-नवीकरण (क्षेत्र-निर्माण क्षमता और आत्म-नवीकरण), भेदभाव क्षमता (व्युत्पन्न अनुयायी आबादी), और सीएससी के फेनोटाइप (प्रवाह साइटोमेट्री और/या पश्चिमी दाग के साथ) का मूल्यांकन करने के लिए रणनीतियां प्रदान करते हैं। कैंसर स्टेम कोशिकाओं को कई मोटे तौर पर वर्णित फेनोटाइपिक मार्कर के माध्यम से पहचाना जा सकता है (तालिका 1देखें) ।

मानव ट्यूमर प्राथमिक संस्कृतियों के रूप में अक्सर स्थापित करने के लिए और संस्कृति में बनाए रखने के लिए चुनौतीपूर्ण हैं, क्षेत्र बनाने प्रोटोकॉल इन नमूनों से निपटने के लिए एक उपकरण प्रदान कर सकता है । एंजाइमैटिक पाचन प्रक्रिया का सुझाव दिया एंडोमेट्रियल ऊतक नमूनों३८से एकल सेल निलंबन प्रदान की है । क्षेत्र बनाने प्रोटोकॉल सीएससी की महत्वपूर्ण संख्या प्रदान करता है, जिसे अन्य साधनों से प्राप्त करना मुश्किल है। त्रिआयामी मॉडल पारंपरिक मोनोलेयर सेल संस्कृतियों की तुलना में विवो स्थिति, अर्थात् शारीरिक सूक्ष्मवातावरण और ट्यूमर विषमता की नकल करने में अधिक कुशल हो सकता है।

ट्यूमर स्फीयर की मोनोक्लोनल उत्पत्ति के बारे में निश्चितता इस प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण कदम है। एकत्रीकरण को कम करना, जो निलंबन संस्कृतियों में होता है, और एकल-सेल निलंबन वितरित करने के लिए सीडिंग घनत्व का एक पूरी तरह से अनुकूलन महत्वपूर्ण24हैं। अन्य लेखकों ने39,40प्रति कुएं में एक ही कोशिका चढ़ाना का सुझाव दिया . इस श्रमसाध्य प्रक्रिया से बचने के लिए, हम यह सुनिश्चित करके इस मुद्दे पर काबू पा लिया एक एकल सेल निलंबन एक मिथाइलसेल्यूलोज-समृद्ध माध्यम में कम घनत्व में चढ़ाया जाता है । इसके पानी की पकड़ और चिपचिपाहट बढ़ाने वाले गुणों23के कारण, मिथाइलसेल्यूलोज एक अर्ध-ठोस माध्यम प्रदान करता है जो प्रवास और एकत्रीकरण से बचता है, जिससे21प्राप्त क्षेत्रों की मोनोक्लोनलिटी सुनिश्चित होती है। संस्कृति में दिनों की संख्या एक और पहलू है जो अनुकूलन पर निर्भर है, क्योंकि 40 माइक्रोन से बेहतर व्यास वाले क्षेत्रों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक दिनों की संख्या प्रत्येक सेल प्रकार के समय24को दोगुना करने पर निर्भर करती है। कम या सीरम-मुक्त माध्यम प्रोटोकॉल की एक और विशेषता है, क्योंकि एफबीएस युक्त माध्यम अनुयायी स्थितियों41में विभेदित कोशिका-विकास के लिए प्रासंगिक है, जैसा कि माता-पिता की कोशिका रेखाओं और व्युत्पन्न अनुयायी कोशिकाओं में है। प्रोटोकॉल विशिष्ट विकास कारकों की स्थिर एकाग्रता के रखरखाव पर निर्भर करता है। ईजीएफ सिग्नलिंग प्लूरीपोटेंसी रास्तों के रखरखाव में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है जबकि बीएफएफएफ42,43के क्षेत्रों की पीढ़ी में योगदान देने वाले माइटोजन के रूप में कार्य करता है .

उपयुक्त तकनीकों से जुड़े क्षेत्र निर्माण प्रोटोकॉल, सीएससी21की विशिष्ट आबादी का विस्तार, अलग-थलग और मूल्यांकन करने का साधन प्रदान करता है। कई लेखकों ने स्टेम सेल जीन अभिव्यक्ति44,45,46,47 और ट्यूमर में स्टेमनेस47,48,एपिथेलियल-मेसेनचिमल संक्रमण44,49 और ट्यूमरजीनिस45,48का अध्ययन करने में इसकी उपयोगिता की ओर इशारा किया है, ताकि नए उपचारों के प्रभाव का मूल्यांकन किया जा सके21,50 और औषधि प्रतिरोध44, 51, और प्राथमिक नमूनों से संस्कृतियों की स्थापना के लिए21,45,46. हालांकि, यह ध्यान रखना जरूरी है कि यह एक संवेदनशील प्रयोग है, जो पर्याप्त संस्कृति स्थितियों पर अत्यधिक निर्भर है । इसके अतिरिक्त, सीएससी असममित डिवीजन52 के कारण क्षेत्र सेलुलर विषमता पेश करते हैं और वीवो आला46में कैंसर स्टेम सेल गठन और रखरखाव की जटिलता के एक अच्छे मॉडल का प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं।

क्षेत्र बनाने प्रोटोकॉल के अलावा, सीएससी का पता लगाने के लिए अन्य कार्यात्मक परखों का उपयोग किया गया है। वीवो ट्यूमर में ट्यूमर36,53ट्यूमर प्राप्त करने के लिए इम्यूनोसमझौता चूहों में कम कोशिका संख्या का टीका आवश्यक है । यह पशु अध्ययन करने के लिए उचित शर्तों की उपलब्धता पर निर्भर करता है, और गैर-प्रजातियों-विशिष्ट माइक्रोएनवायरमेंट के कारण, जीवित कोशिकाओं की वसूली चुनौतीपूर्ण हो सकती है। एक कॉलोनी बनाने इकाई परख, सेल की क्षमता का मूल्यांकन करने के बाद वे कम घनत्व५२पर चढ़ाया जाता है, कम सेल संख्या प्रदान करता है । साइड-पॉपुलेशन फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (FACS) पर निर्भर करता है ताकि होस्च 33342 दाग को बाहर निकालने की क्षमता के साथ कोशिकाओं के एक समूह को अलग किया जा सके। यह संवेदनशील विधि एटीपी बाध्यकारी कैसेट प्रोटीन (एबीसी) ट्रांसपोर्टरों की अभिव्यक्ति पर निर्भर करती है, जो ड्रग एफलक्स54के लिए जिम्मेदार है। फिर भी, पक्ष-जनसंख्या कुछ नुकसानों से जुड़ी हुई है, अर्थात्, सीएससी के कुछ फेनोटाइप के लिए गैर-विशिष्टता और रंग की विशेषताएं, जो विषाक्त है और काफी हद तक प्रयोगात्मक स्थितियों (तापमान, एकाग्रता)54,55से प्रभावित है। ALDEFLUOR इंट्रासेलर एएलडीएच गतिविधि के साथ कोशिकाओं की पहचान के लिए एक और प्रवाह साइटोमेट्री आधारित परख है। मुख्य मुद्दा अध्ययनों के बीच प्रजनन क्षमता की कमी है जो संस्कृति की स्थिति54से अत्यधिक प्रभावित प्रतीत होती है .

क्षेत्र बनाने प्रोटोकॉल अक्सर फेनोटाइपिक विश्लेषण के साथ संयुक्त है, जैसा कि हमने यहां प्रस्तावित किया था, सीएससी13,14की पहचान करने के लिए पूरक तरीकों की उपयोगिता पर जोर दिया। हमने क्षेत्र बनाने वाले प्रोटोकॉल के माध्यम से सीएससी संवर्धन और प्रवाह साइटोमेट्री और पश्चिमी दाग द्वारा जैव रासायनिक मार्कर के मूल्यांकन के माध्यम से स्टेमनेस की आगे की पुष्टि की सिफारिश की। फ्लो साइटोमेट्री अध्ययनों ने क्षेत्रों के भीतर विषम आबादी की पहचान की। वास्तव में, सीडी44 उच्च/CD24कमकोशिकाओं द्वारा इस प्रोटोकॉल में प्रतिनिधित्व किए गए अध्ययनों में सीएससी में एक संवर्धन है । सीएससी असममित आत्म नवीकरण24के कारण, अन्य सेल फेनोटाइप की भी पहचान की गई। CD133 के मामले में, प्रतिनिधि परिणाम उच्च उपजी के साथ आबादी को ईसीसी-1 सेल लाइन के मामले में सकारात्मक होने के लिए दिखाया, लेकिन RL95-2 क्षेत्रों में नकारात्मक । यह वर्णित कुछ सीएससी मार्कर की विशिष्टता की कमी को इंगित करता है, जो इन कोशिकाओं के लिए अद्वितीय नहीं हैं और फेनोटाइप की प्लास्टिसिटी के साथ भिन्न हो सकते हैं, और स्टेमनेस की पुष्टि करने के लिए रणनीतियों के संयोजन का उपयोग करने के महत्व के लिए।

पश्चिमी दाग एक वैकल्पिक पद्धति है जो कुछ मामलों में उपयोगी हो सकती है। उदाहरण के लिए, जबकि ALDH गतिविधि मोटे तौर पर प्रयोग किया जाता है, अब यह ज्ञात है कि कई आइसोफॉर्म ALDEFLUOR चयापचय54में योगदान करते हैं। इस प्रकार, विशिष्ट एंटीजन-एंटीबॉडी विधियां अधिक विश्वसनीय हो सकती हैं और हमने पहले से ही ALDH प्रोटीन अभिव्यक्ति और स्टेमनेस13,14के बीच संबंध दिखाया है।

क्षेत्र बनाने की क्षमता, आत्म नवीकरण और व्युत्पन्न अनुयायी आबादी सीएससी की क्षमता का प्रतिनिधित्व करने के लिए अनिश्चित काल के विभाजन और एक विभेदित संतान है, जो चिकित्सकीय पतन, मेटास्मेटाइजेशन और उपचार के लिए प्रतिरोध के रूप में घटनाओं के लिए अनुवाद9का उत्पादन । सीएससी में दवा प्रतिरोध को बहुदवा प्रतिरोध (एमडीआर) झिल्ली प्रोटीन, विषहरण तंत्र में शामिल ALDH अभिव्यक्ति, डीएनए मरम्मत तंत्र, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के खिलाफ सुरक्षा और एपोप्टोसिस56के प्रतिरोध से समझाया जा सकता है। सीएससी में उनकी प्लास्टिसिटी के कारण शांत होने की क्षमता है और यह ड्रग रेजिस्टेंस के तंत्र के रूप में उभरा है । सेल-साइकिल गिरफ्तार विभेदित कोशिकाओं57के कारण इस आबादी को कीमो और रेडियोथेरेपी से बख्शा जा सकता है। गोले एक ट्यूमर आबादी हैं , जिनमें पारंपरिक उपचार में उपयोग की जाने वाली साइटोस्टैटिक दवाओं के प्रतिरोध की सूचना दी गई है और यहलक्षितउपचार54,58,59के संयोजन के लिए भी ध्यान केंद्रित कर रहा है । क्षेत्रों की संवेदनशीलता स्तन और एंडोमेट्रियल कैंसर में उपयोग किए जाने वाले साइटोस्टैटिक्स के लिए परीक्षण किया जा सकता है। इसके अलावा, एक ट्यूमर नमूने से सीएससी के अलगाव प्रत्येक ट्यूमर के लिए विशिष्ट चिकित्सा के नैदानिक आवेदन के लिए एक मंच हो सकता है, प्रतिरोध और परिणामी आवर्ती रोग की भविष्यवाणी ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन को पुर्तगाली सोसायटी ऑफ स्त्री रोग द्वारा 2016 अनुसंधान पुरस्कार के माध्यम से और सिमागो द्वारा वित्त पोषित किया गया था। सीएनसी. IBILI विज्ञान और प्रौद्योगिकी, पुर्तगाल (UID/NEU/04539/2013) के लिए फाउंडेशन के माध्यम से समर्थित है, और सह FEDER द्वारा वित्त पोषित-प्रतिस्पर्धा (POCI-01-0145-FEDER-007440) । Coimbra अस्पताल और Universitary केंद्र (CHUC) ट्यूमर बैंक, स्वास्थ्य के लिए है CHUC नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित और पुर्तगाली राष्ट्रीय डेटा संरक्षण आयोग द्वारा, संस्था के स्त्री रोग सेवा में पीछा रोगियों के एंडोमेट्रियल नमूनों का स्रोत था । चित्रा 1 सर्वियरमेडिकल आर्ट का उपयोग करके उत्पादित किया गया था, जो www.servier.com से उपलब्ध है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute ethanol Merck Millipore 100983
Accutase Gibco A1110501 StemPro Accutas Cell Dissociation Reagent
ALDH antibody Santa Cruz Biotechnology SC166362
Annexin V FITC BD Biosciences 556547
Antibiotic antimycotic solution Sigma A5955
BCA assay Thermo Scientific 23225 Pierce BCA Protein Assay Kit
Bovine serum albumin Sigma A9418
CD133 antibody Miteny Biotec 293C3-APC Allophycocyanin (APC)
CD24 antibody BD Biosciences 658331 Allophycocyanin-H7 (APC-H7)
CD44 antibody Biolegend 103020 Pacific Blue (PB)
Cell strainer BD Falcon 352340 40 µM
Collagenase, type IV Gibco 17104-019
cOmplete Mini Roche 118 361 700 0
Dithiothreitol Sigma 43815
DMEM-F12 Sigma D8900
DNAse I Roche 11284932001
ECC-1 ATCC CRL-2923 Human endometrium adenocarcinoma cell line
Epidermal growth factor Sigma E9644
Fibroblast growth factor basic Sigma F0291
Haemocytometer VWR HERE1080339
HCC1806 ATCC CRL-2335 Human mammary squamous cell carcinoma cell line
Insulin, transferrin, selenium Solution Gibco 41400045
MCF7 ATCC HTB-22 Human mammary adenocarcinoma cell line
Methylcellulose AlfaAesar 45490
NaCl JMGS 37040005002212
Poly(2-hydroxyethyl-methacrylate Sigma P3932
Putrescine Sigma P7505
RL95-2 ATCC CRL-1671 Human endometrium carcinoma cell line
Sodium deoxycholic acid JMS EINECS 206-132-7
Sodium dodecyl sulfate Sigma 436143
Tris JMGS 20360000BP152112
Triton-X 100 Merck 108603
Trypan blue Sigma T8154
Trypsin-EDTA Sigma T4049
ß-actin antibody Sigma A5316

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References

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