使用多路复用共免疫沉淀对蛋白质相互作用网络动力学进行量化
Summary
定量多路复用免疫沉淀 （QMI） 使用流式细胞测定技术，灵敏地检测两个样本之间靶向蛋白-蛋白质相互作用的丰度差异。QMI可以使用少量的生物材料进行，不需要基因工程标签，并可以适应任何先前定义的蛋白质相互作用网络。
Abstract
动态蛋白-蛋白质相互作用控制细胞行为，从运动到DNA复制到信号转导。然而，监测蛋白质相互作用网络中多种蛋白质之间的动态相互作用在技术上是困难的。在这里，我们提出了定量多路复用免疫沉淀 （QMI） 的协议，它允许根据暴露检测到的共享复合物中蛋白质的相对荧光测量，定量评估蛋白质相互作用的褶皱变化表面表位（PiSCES）。在QMI中，来自细胞解物的蛋白质复合物被免疫沉淀到微球上，然后用标记的抗体探测不同的蛋白质，以量化PiSCES的丰度。免疫沉淀抗体与不同的 MagBead 光谱区域结合，使流式细胞仪能够区分多个平行免疫沉淀，同时量化与每个光谱抗体相关的量。与其他免疫沉淀方法相比，QMI不需要遗传标记，可以使用最少的生物材料进行。QMI可以适应任何定义的相互作用蛋白组，到目前为止已经用于描述T细胞和神经元谷氨酸突触中的信号网络。研究结果产生了新的假说，具有潜在的诊断和治疗应用。该协议包括执行 QMI 的指令，从初始抗体面板选择到运行检测和分析数据。QMI测定的初始组装涉及筛选抗体以生成面板，并实证确定适当的莱沙缓冲液。随后的试剂制备包括共价耦合免疫沉淀抗体与MagBeads，以及生物仿菌探针抗体，以便它们可以被链球菌-结合荧光剂标记。为了运行测定，裂解物与MagBeads在一夜之间混合，然后用不同的探针抗体分珠和孵育，然后贴上荧光度标签，然后通过流式细胞仪读取。执行两个统计测试，以识别在实验条件之间差异很大的 PiSCES，并使用热图或节点边缘图对结果进行可视化。
Introduction
动态蛋白质-蛋白质相互作用构成分子信号级联和移动结构，是大多数细胞生理学的功能基础。这些过程通常被描述为线性信号通路，在基于单个输入的稳定状态之间切换，但实验和建模数据清楚地显示它们作为集成网络2、3、 4.就G蛋白而言，不同的受体通常具有激活同一G蛋白的能力，而单个受体也可以激活多种类型的G蛋白5，6。为了使相对较少的G蛋白类专门调节大量的细胞功能，如突触传输，激素调节和细胞迁移，细胞必须集成和区分这些信号4,5.有证据表明，对于G蛋白和其他蛋白质来说，这种信号特异性主要是基于精细调整的蛋白质-蛋白质相互作用及其时间动力学1，3。4,5,6,7.由于信令网络由具有多个输入、输出和反馈回路的动态蛋白质复合物组成，因此单个扰动有机会改变细胞生理的整体静时平衡4 ，7.现在人们普遍认为，信号应从网络的角度来研究，以便更好地了解多个输入的集成如何控制健康和疾病7、8、离散细胞功能。 9，10，11，12，13.鉴于此，开发了定量多路免疫沉淀 （QMI）， 以收集有关动态蛋白质相互作用网络中折叠变化的中等通量定量数据。
QMI 是一种基于抗体的测定，其中细胞解结物与一组免疫沉淀抗体进行孵育，这些抗体与含有不同比例荧光染料的磁珠共价耦合。将特定的抗体耦合到不同的磁珠类别，可以同时从同一致莱沙中同时对多个靶蛋白进行共免疫沉淀。在免疫沉淀 （IP） 之后，用第二种荧光荧光结合探针抗体（或与荧光磷结合链球菌联合剂联合的亲化抗体）孵育磁珠。每个 IP 抗体-探针抗体对或 PiSCES（暴露表面表位检测到的共享复合物中的蛋白质）之间的共结，然后通过流式细胞测定检测，并可在不同之间定量比较样本条件14.图1中的插图显示了运行QMI测定的步骤，包括由荧光结合探针抗体标记的带有免疫沉淀蛋白复合物的磁珠图（图1C）。
QMI 的灵敏度取决于赖酸与用于免疫沉淀的磁珠数量的蛋白质浓度，与其他基质相比，要检测 10% 折叠变化的分辨率只需要少量的起始材料共同知识产权方法14，15 。例如，QMI 中使用的起始材料量与三明治酶链接免疫吸附测定 （ELISA） 所需的原料量类似，但在单个 QMI 检测中检测到多个相互作用。使用 20 个 IP 和 20 个探针靶点进行的 QMI 测定使用从 4 mm 皮肤活检中分离的 1-5 x 105初级 T 细胞、从小鼠前额皮质的 3 mm 日冕部分或 3 x 106培养小鼠原发性小鼠原发性中分离的 P2 突触体制剂皮质神经元14，16，17。这种敏感性使 QMI 可用于分析可用性有限的细胞或组织，如临床样本。
QMI 可以适用于任何先前定义的蛋白质相互作用网络（前提是有抗体可用），并且到目前为止已经开发用于分析 T 细胞抗原受体 （TCR） 信号体和神经元谷氨酸突触中的蛋白质子集17,18.在T细胞受体信号的研究中，QMI首先用于识别PiSCES中的刺激引起的变化，然后区分自体免疫患者与对照组，检测内源性自身免疫信号，最后产生假说涉及一个不平衡的疾病相关的相互作用的子网络14。最近，同一个QMI面板被用来确定胸腺细胞的选择是由定量而不是质量差异在TCR相关蛋白质信号19。在神经元中，QMI用于描述不同类型的输入信号的蛋白质相互作用网络的输入特定重新排列，以支持新出现的突触可塑性模型17。此外，这个突触QMI面板用于识别七个自闭症小鼠模型的差异，根据PiSCES生物特征将模型聚集到子组中，并准确假设以前未识别的共享分子缺陷在一个模型16。类似的方法可用于筛选可能对不同药物治疗作出反应的其他子组，或将药物分配给特定反应的子组。除了基础科学之外，QMI在诊断、患者分型和药物开发方面也有潜在的应用。
为了组装QMI抗体面板，下面第1节描述了初始抗体筛选和选择方案。一旦确定抗体面板，第 2 节将所选抗体与磁性磁珠的偶联方案与 IP 磁珠结合，以及所选探针抗体的生物仿当。第 3 节描述了在细胞或组织莱沙上运行 QMI 测定的协议。最后，由于单个实验可以生成 +5 x 105个单个数据点，因此第 4 节提供了有助于数据处理、分析和可视化的说明和计算机代码。第 2-4 节中描述的工作流概述如图1所示。
Protocol
Representative Results
Discussion
QMI 测定需要在抗体面板开发、设备和试剂方面投入大量资金，但一旦建立了检测，就可以收集高维数据来观察蛋白质相互作用网络，因为它们对实验控制的反应刺激。从技术上讲，QMI 需要仔细移液和跟踪样品和抗体井位置。仔细标记化片是有用的，就像在纸上制作井位的详细模板一样，然后保存该模板进行数据分析。在任何时候保持珠子和流源性冷的重要性，包括在流式细胞仪微孔板载体中（?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者希望感谢 Tessa Davis 对 QMI 测定开发做出的重要贡献，以及史密斯和施鲁姆实验室的现任和前任成员的技术指导和智力投入。这项工作由NIMH赠款R01 MH113545和R00 MH 102244资助。
Materials
| 96-well flat bottomed plates | Bio Rad | 171025001 | |
| 96-well PCR plates | VWR | 82006-704 | |
| Bioplex 200 System with HTF | Bio Rad | 171000205 | modiefied to keep partially refrigerated, see Figure S1 for details |
| Bio-Plex Pro Wash Station | Bio Rad | 30034376 | |
| BSA | Sigma | ||
| CML beads | Invitrogen | C37481 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin | Thermo Scientific | A39256 | |
| MagPlex Microspheres | Luminex | MC12xxx-01 | xxx is the 3 digit bead region |
| Melon Gel IgG Spin Purification Kit | Thermo Scientific | 45206 | used for antibody purification |
| MES | Sigma | M3671 | |
| Microplate film, non-sterile | USA Scientific | 2920-0000 | |
| Phosphotase inhibitor cocktail #2 | Sigma | P5726 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| Sandwich Prep Refrigerator | Norlake | SMP 36 15 | for custom refrigeration of Bioplex 200 |
| Sodium fluoride | Sigma | 201154 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma | 450243 | |
| Streptavidin-PE | BioLegend | 405204 | |
| Sulfo NHS | Thermo Scientific | A39269 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP152 |
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