Количественная оценка динамики взаимодействия белков с использованием мультиплексного со-иммунопрециации
Summary
Количественный мультиплекс иммунопрецитификации (ЗМИ) использует поток цитометрии для чувствительного обнаружения различий в изобилии целевых белково-белковых взаимодействий между двумя образцами. ЗМИ может быть выполнена с использованием небольшого количества биоматериала, не требует генетически модифицированных тегов, и может быть адаптирована для любой ранее определенной сети взаимодействия белка.
Abstract
Динамические белково-белковые взаимодействия контролируют клеточное поведение, от подвижности до репликации ДНК и сигнала трансдукции. Однако, мониторинг динамических взаимодействий между несколькими белками в сети взаимодействия белка технически трудно. Здесь мы представляем протокол количественного мультиплексного иммунопрециционного протеина (ЗМИ), который позволяет количественно оценивать изменения складов в белковых взаимодействиях на основе относительных измерений флуоресценции белков в общих комплексах, обнаруженных exposed Поверхностные эпитопы (PiSCES). В ЗМИ белковые комплексы из клеточных лисатов иммунопронифицируются на микросферы, а затем исследуются с помеченным антителом для другого белка, чтобы количественно оставить PiSCES. Иммунопрефференционные антитела спрягаются с различными спектральными областями MagBead, что позволяет цитометро потока дифференцировать несколько параллельных иммунопрециций и одновременно количественно количество антител зонда, связанных с каждым из них. ЗМИ не требует генетической маркировки и может быть выполнена с использованием минимального биоматериала по сравнению с другими методами иммунопреципции. ЗМИ может быть адаптирован атлетировал для любой определенной группы взаимодействующих белков, и до сих пор использовался для характеристики сигнальных сетей в Т-клетках и нейрональных синапсах глутамата. Результаты привели к порождению новых гипотез с потенциальным диагностическим и терапевтическим применением. Этот протокол включает в себя инструкции для выполнения ЗМИ, от первоначального выбора панели антител до беговых анализов и анализа данных. Первоначальная сборка асссея ЗМИ включает скрининговых антител для создания панели и эмпирически определение соответствующего буфера лиза. Последующий препарат реагента включает в себя ковалентно екосочетание иммунопрецитификации антител к MagBeads, и биотинилатации антител зонда, чтобы они могли быть помечены стрептавидин-конъюгированный фторофор. Для запуска асса, lysate смешивается с MagBeads ночь, а затем бисер делятся и инкубируются с различными антителами зонда, а затем флюорофор этикетки, и читать поток цитометрии. Для выявления PiSCES, которые значительно различаются между экспериментальными условиями, проводятся два статистических теста, и результаты визуализироваться с помощью тепловых карт или диаграмм узла.
Introduction
Динамические белково-белковые взаимодействия представляют собой молекулярные сигнальные каскады имотил-структуры, которые являются функциональной основой большинства клеточной физиологии 1. Эти процессы часто изображаются как линейные сигнальные пути, которые переключаются между устойчивыми состояниями на основе одного ввода, но экспериментальные и модельные данные ясно показывают, что они функционируют как интегрированные сети2,3, 4. В случае G белков, различные рецепторы часто имеют возможность активировать тот же белок G, и один рецептор может также активировать более одного типа белка G5,6. Для того, чтобы относительно небольшое количество классов белка G специально модулировать широкий спектр клеточных функций, таких как синаптическая передача, гормональная регуляция, и миграция клеток, клетки должны как интегрировать и дифференцировать эти сигналы4 , 5. Доказательства показали, что эта специфичность сигнала, для G белков, а также другие, в первую очередь происходит на основе тонко настроенных белково-белковых взаимодействий и их височной динамики1,3, 4 , 5 , 6 , 7. Поскольку сигнальные сети состоят из динамических белковых комплексов с несколькими входными данными, выходами и циклами обратной связи, одно возмущение имеет возможность изменить общий гомеостатический баланс физиологии клетки4 ,7. В настоящее время широко ели, что сигнализация должна быть рассмотрена с точки зрения сети, с тем чтобы лучше понять, как интеграция нескольких входов контролирует дискретные клеточные функции в области здравоохранения и болезни7,8, 9,10,11,12,13. В свете этого, Количественный мультиплекс иммунопреципсии (ЗМИ) был разработан для сбора средней пропускной связи, количественные данные об изменениях раза в динамических сетей взаимодействия белка.
ЗМИ является антитела основе анализ, в котором клеточный лизат инкубируется с панелью иммунопрецит антител, которые ковалентно связаны с магнитными бусинами, содержащими различные соотношения флуоресцентных красителей. Наличие специфических антител в сочетании с отдельными классами магнитного биса позволяет одновременно со-иммунопрецитировать несколько белков-мишеней из одного и того же лизата. После иммунопреципиции (IP), магнитные бусы инкубируются со вторым, фторофор-конъюгированных антитела зонда (или биотинилаповые антитела в сочетании с фторофором-конъюгированный стрептавидин). Со-ассоциации между белками, распознаемыми каждой антител-зондом IP, или PiSCES (белки в общих комплексах, обнаруженных открытыми поверхностными эпитопами), затем обнаруживаются цитометрией потока и могут быть количественно сопоставлены между различными условия выборки14. Иллюстрации на рисунке 1 показывают шаги, участвующие в запуске анализом ЗМИ, в том числе диаграмму магнитных бусин с иммунопромизированными белковыми комплексами, помеченными флуоресцентно спряженных антителами зонда (рисунок1C).
Чувствительность ЗМИ зависит от концентрации белка лизата относительно количества магнитных бусин, используемых для иммунопрециционности, и достижение разрешения для обнаружения 10% раз изменения требует лишь небольшое количество исходного материала по сравнению с другими методы совместного IP14,15. Например, количество исходного материала, используемого в ЗМИ, аналогично тому, которое требуется для сэндвича Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA), но несколько взаимодействий обнаруживаются в одном анализе ЗМИ. Анализы с использованием 20 IPs и 20 целей зонда были выполнены с использованием 1-5 х 105 первичных Т-клеток, изолированных от биопсии кожи 4 мм, Синаптосомные препараты P2 из 3 мм корональной секции мыши префронтальной коры, или 3 х 106 культивированных мышей первичной корковых нейронов14,16,17. Эта чувствительность делает ЗМИ полезным для анализа клеток или тканей с ограниченной доступностью, таких как клинические образцы.
ЗМИ может быть адаптирована для любой ранее определенной сети взаимодействия белков (при условии, что антитела доступны), и на сегодняшний день была разработана для анализа Т-клеточного рецептора антигена (TCR) сигналосомы и подмножество белков на глутаматергических синапсов в нейронах 17 Лет , 18. В исследованиях Сигнализирующих рецепторов Т-клеток, ЗМИ был впервые использован для выявления вызванных стимуляцией изменений в PiSCES, а затем, чтобы отличить аутоиммунных пациентов от контрольной группы, обнаружить эндогенные аутоиммунные сигнализации, и, наконец, для создания гипотеза, связанная с несбалансированной болезнью, связанной с подсетью взаимодействий14. Совсем недавно, та же панель ЗМИ была использована для определения того, что выбор тимоцита определяется количественными, а не качественными различиями в TCR-ассоциированного белка сигнализации19. В нейронах, ЗМИ был использован для описания входной конкретной перестановки сети взаимодействия белка для различных типов входных сигналов таким образом, который поддерживает вновь возникающих моделей синаптической пластичности17. Кроме того, эта синаптическая панель ЗМИ была использована для выявления различий в семи моделях мыши аутизма, кластера моделей в подгруппы на основе их PiSCES биоподписей, и точно предположить общий молекулярный дефицит, который был ранее непризнанным в одной из моделей16. Аналогичный подход можно было бы использовать для проверки других подгрупп, которые могли бы реагировать на различные методы лечения наркомании, или назначать лекарства конкретным адаптивным подгруппам. В дополнение к фундаментальной науке, помимо фундаментальной науки, у компании «МИ» есть потенциальное применение в области диагностики, субтипирования пациентов и разработки лекарственных средств.
Для того чтобы собрать панель антитела зМИ, начальные протоколы скрининга антител и выбора описаны в разделе 1, ниже. После выявления панелей антител в разделе 2 описаны протоколы спряжения выбранных антител к магнитным бусинам для ИС и биотинилации выбранных антител зонда. Протокол для запуска анализа ЗМИ на лисаты клеток или тканей описан в разделе 3. Наконец, поскольку один эксперимент может генерировать отдельные точки данных в размере 5 х 10 5, в разделе 4 предусмотрены инструкции и компьютерные коды для оказания помощи в обработке данных, анализе и визуализации. Обзор рабочего процесса, описанного в разделах 2-4, показан на рисунке 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Анализ ЗМИ требует значительных инвестиций в разработку антител панели, оборудование и реагенты, но как только анализ установлен, можно собирать высокомерные данные наблюдения белковых сетей взаимодействия, как они реагируют на экспериментально контролируемых Стимулы. Технически, З?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы отметить Тесса Дэвис за важный вклад в развитие исследования ЗМИ, а также нынешних и бывших членов лабораторий Смита и Шрума за техническое руководство и интеллектуальный вклад. Эта работа финансировалась NIMH гранты R01 MH113545 и R00 MH 102244.
Materials
| 96-well flat bottomed plates | Bio Rad | 171025001 | |
| 96-well PCR plates | VWR | 82006-704 | |
| Bioplex 200 System with HTF | Bio Rad | 171000205 | modiefied to keep partially refrigerated, see Figure S1 for details |
| Bio-Plex Pro Wash Station | Bio Rad | 30034376 | |
| BSA | Sigma | ||
| CML beads | Invitrogen | C37481 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin | Thermo Scientific | A39256 | |
| MagPlex Microspheres | Luminex | MC12xxx-01 | xxx is the 3 digit bead region |
| Melon Gel IgG Spin Purification Kit | Thermo Scientific | 45206 | used for antibody purification |
| MES | Sigma | M3671 | |
| Microplate film, non-sterile | USA Scientific | 2920-0000 | |
| Phosphotase inhibitor cocktail #2 | Sigma | P5726 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| Sandwich Prep Refrigerator | Norlake | SMP 36 15 | for custom refrigeration of Bioplex 200 |
| Sodium fluoride | Sigma | 201154 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma | 450243 | |
| Streptavidin-PE | BioLegend | 405204 | |
| Sulfo NHS | Thermo Scientific | A39269 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP152 |
Riferimenti
- Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes and Development. 14 (9), 1027-1047 (2000).
- Rodríguez-Jorge, O., et al. Cooperation between T cell receptor and Toll-like receptor 5 signaling for CD4. Science Signaling. 12 (577), (2019).
- Bugaj, L. J., et al. Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway. Science. 361 (6405), (2018).
- Pawson, T. Dynamic control of signaling by modular adaptor proteins. Current Opinion in Cell Biology. 19 (2), 112-116 (2007).
- Hamm, H. E. The many faces of G protein signaling. Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 669-672 (1998).
- Lohse, M. J., Hofmann, K. P. Spatial and Temporal Aspects of Signaling by G-Protein-Coupled Receptors. Molecular Pharmacology. 88 (3), 572-578 (2015).
- Eltschinger, S., Loewith, R. TOR Complexes and the Maintenance of Cellular Homeostasis. Trends in Cell Biology. 26 (2), 148-159 (2016).
- Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (2), 99-111 (2005).
- Komarova, N. L., Zou, X., Nie, Q., Bardwell, L. A theoretical framework for specificity in cell signaling. Molecular Systems Biology. 1, 23 (2005).
- Schrum, A. G., Gil, D. Robustness and Specificity in Signal Transduction via Physiologic Protein Interaction Networks. Clinical and Experimental Pharmacology. 2 (3), (2012).
- De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Computational Biology. 6 (6), 1000807 (2010).
- Ron, D., Walter, P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (7), 519-529 (2007).
- Bogdan, A. R., Miyazawa, M., Hashimoto, K., Tsuji, Y. Regulators of Iron Homeostasis: New Players in Metabolism, Cell Death, and Disease. Trends in Biochemical Sciences. 41 (3), 274-286 (2016).
- Smith, S. E., et al. Multiplex matrix network analysis of protein complexes in the human TCR signalosome. Science Signaling. 9 (439), 7 (2016).
- Schrum, A. G., et al. High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Science’s STKE. 2007 (389), (2007).
- Brown, E. A., et al. Clustering the autisms using glutamate synapse protein interaction networks from cortical and hippocampal tissue of seven mouse models. Molecular Autism. 9 (1), 48 (2018).
- Lautz, J. D., Brown, E. A., Williams VanSchoiack, A. A., Smith, S. E. P. Synaptic activity induces input-specific rearrangements in a targeted synaptic protein interaction network. Journal of Neurochemistry. 146 (5), 540-559 (2018).
- Smith, S. E., et al. Signalling protein complexes isolated from primary human skin-resident T cells can be analysed by Multiplex IP-FCM. Experimental Dermatology. 23 (4), 272-273 (2014).
- Neier, S. C., et al. The early proximal αβ TCR signalosome specifies thymic selection outcome through a quantitative protein interaction network. Science Immunology. 4 (32), (2019).
- Davis, T. R., Schrum, A. G. IP-FCM: immunoprecipitation detected by flow cytometry. Journal of Visualized Expiriments. (46), (2010).
- Smith, S. E., et al. IP-FCM measures physiologic protein-protein interactions modulated by signal transduction and small-molecule drug inhibition. PLoS One. 7 (9), 45722 (2012).
- Lautz, J., et al. Activity-dependent changes in synaptic protein complex composition are consistent in different detergents despite differential solubility. BioRXiv. , (2019).
- Langfelder, P., Horvath, S. WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis. BMC Bioinformatics. 9, 559 (2008).
- Schrum, A. G., Gil, D., Turka, L. A., Palmer, E. Physical and functional bivalency observed among TCR/CD3 complexes isolated from primary T cells. Journal of Immunology. 187 (2), 870-878 (2011).
