Kvantificering af protein interaktions netværk dynamik ved hjælp af Multiplexed Co-Immunopræcipitation

Summary

Kvantitativ multiplex Immunoprecipitation (QMI) bruger flow cytometri til følsom påvisning af forskelle i den overflod af målrettede protein-protein interaktioner mellem to prøver. QMI kan udføres ved hjælp af en lille mængde biomateriale, kræver ikke genetisk manipulerede Tags, og kan tilpasses til alle tidligere definerede protein interaktion netværk.

Abstract

Dynamiske protein-protein interaktioner kontrol cellulære adfærd, fra motilitet til DNA-replikation til at signalere transduktion. Det er imidlertid teknisk vanskeligt at overvåge dynamiske interaktioner mellem flere proteiner i et protein interaktions netværk. Her præsenterer vi en protokol for kvantitativ multiplex Immunopræcipitation (QMI), som giver mulighed for kvantitativ vurdering af fold ændringer i protein interaktioner baseret på relative fluorescens målinger af proteiner i delte komplekser detekteret af eksponerede Overflade epitoper (fiskene). I QMI, protein komplekser fra celle lysater er immunoprecipitated på mikrosfærer, og derefter probed med et mærket antistof for et andet protein for at kvantificere den overflod af fiskene. Immunopræcipitation antistoffer er konjugeret til forskellige MagBead spektral regioner, som tillader et flow flowcytometer at differentiere flere parallelle immunopræcipitationer og samtidig kvantificere mængden af Probe antistof forbundet med hver. QMI kræver ikke genetisk mærkning og kan udføres ved hjælp af minimal biomaterialet sammenlignet med andre immunopræcipitation metoder. QMI kan tilpasses til enhver defineret gruppe af interagerende proteiner, og har hidtil været brugt til at karakterisere signalering netværk i T-celler og neuronal glutamat synapser. Resultater har ført til ny hypotese generation med potentielle diagnostiske og terapeutiske anvendelser. Denne protokol indeholder instruktioner til at udføre QMI, fra den oprindelige antistof panel udvælgelse til at køre assays og analysere data. Den indledende samling af en QMI-analyse omfatter screening antistoffer til at generere et panel, og empirisk bestemmelse af en passende lysis buffer. Det efterfølgende reagens præparat omfatter kovalent tilkobling af chromatinimmunpræcipitation antistoffer mod magbeads og biotinylerende Probe antistoffer, så de kan mærkes med en streptavidin-konjugeret fluorophore. For at køre analysen blandes lysat med magbeads natten over, og derefter opdeles perler og inkuberet med forskellige Probe antistoffer, og derefter en fluoroforet etiket og læses af flowcytometri. To statistiske tests udføres for at identificere fiskene, der afviger betydeligt mellem eksperimentelle forhold, og resultaterne visualiseres ved hjælp af Heatmaps eller node-Edge diagrammer.

Introduction

Dynamisk protein-protein interaktioner udgør de molekylære signalering kaskader og motile sædceller strukturer, der er det funktionelle grundlag for de fleste cellulære fysiologi¹. Disse processer er ofte afbildet som lineære signalerings veje, der skifter mellem stabile tilstande baseret på enkelte indgange, men eksperimentelle og modellerings data viser tydeligt, at de fungerer som integrerede netværk^{2,3, 4}. i tilfælde af G-proteiner har forskellige receptorer ofte evnen til at aktivere det samme G-protein, og en enkelt receptor kan også aktivere mere end én type g-protein^5,6. For at det relativt lille antal G protein klasser specifikt moduere en bred vifte af cellulære funktioner såsom synaptisk transmission, hormon regulering, og celle migration, celler skal både integrere og differentiere disse signaler^{4 , 5}. dokumentation har vist, at dette signal specificitet for G-proteiner såvel som andre primært er afledt på grundlag af finjusterede protein-protein interaktioner og deres tidsmæssige dynamik^{1,3, 4 , 5 , 6 , 7}. da signalerings netværk består af dynamiske protein komplekser med flere indgange, udgange og feedback-sløjfer, har en enkelt forstyrrelse mulighed for at ændre den samlede homeostatiske balance i en celles fysiologi^{4 ,7}. Det er nu almindeligt aftalt, at signalering skal undersøges fra et netværk perspektiv for bedre at forstå, hvordan integrationen af flere indgange styrer diskrete cellulære funktioner i sundhed og sygdom^{7,8, 9,10,11,12,13}. I lyset af dette, kvantitative multiplex Immunoprecipitation (QMI) blev udviklet til at indsamle medium-gennemløb, kvantitative data om fold ændringer i dynamiske protein interaktion netværk.

QMI er en antistof baseret analyse, hvor celle lysat inkuberet med et panel af immunopræcipitation antistoffer, der er kovalent koblet til magnetiske perler, der indeholder forskellige forhold af fluorescerende farvestoffer. At have specifikke antistoffer koblet til forskellige magnetiske perle klasser giver mulighed for samtidige Co-immunoprecipitation af flere målproteiner fra det samme lysat. Efter immun præcipitation (IP) inkuberet magnetiske perler med et sekund, fluorophore-konjugeret Probe-antistof (eller biotinyleret antistof i forbindelse med fluorophore-konjugeret streptavidin). Co-associationer mellem de proteiner, der genkendes af hvert IP-antistof-Probe-antistofpar eller fiskene (proteiner i delte komplekser, der påvises ved eksponerede overflade epitoper), detekteres derefter ved flowcytometri og kan kvantitativt sammenlignes mellem forskellige prøvebetingelser¹⁴. Illustrationerne i figur 1 viser de trin, der er forbundet med at køre en QMI-analyse, herunder et diagram af magnetiske perler med immunopræcipiterede protein komplekser mærket med fluorescently konjugeret Probe antistoffer (figur 1C).

Følsomheden af QMI afhænger af den proteinkoncentration af lyset i forhold til antallet af magnetiske perler, der anvendes til immunoprecipitation, og opnåelse af en opløsning til at opdage 10% fold ændringer kræver kun en lille mængde af udgangsmateriale i forhold til andre Co-IP-metoder^14,15. For eksempel svarer mængden af udgangsmateriale, der anvendes i QMI, til det, der kræves til en sandwich enzym-forbundet ImmunoSorbent assay (ELISA), men der påvises flere interaktioner i en enkelt QMI-analyse. QMI assays ved hjælp af 20 IPs og 20 sonde mål er blevet udført ved hjælp af 1-5 x 10⁵ primære T-celler isoleret fra en 4 mm hudbiopsi, P2 synaptosomale præparater fra en 3 mm koronal del af mus præfrontal cortex, eller 3 x 10⁶ kulturperler mus primære kortikale neuroner^14,16,17. Denne følsomhed gør QMI nyttig til analyse af celler eller væv med begrænset tilgængelighed, såsom kliniske prøver.

QMI kan tilpasses til enhver tidligere defineret protein interaktion netværk (forudsat at antistoffer er tilgængelige), og til dato er blevet udviklet til at analysere T-celle antigen receptor (TCR) signalosome og en delmængde af proteiner på glutamaterge synapser i neuroner ^{17 , 18}. i studier af T-celle receptor signalering blev QMI først brugt til at identificere stimulations inducerede ændringer i fiskene, og derefter til at skelne autoimmune patienter fra en kontrolgruppe, detektere endogene autoimmune signalering og til sidst at generere en hypotese, der involverer et ubalanceret sygdoms associeret under netværk af interaktioner¹⁴. For nylig blev det samme QMI-panel anvendt til at bestemme, at thymocyt-selektion bestemmes af kvantitative snarere end kvalitative forskelle i TCR-associeret protein signalering¹⁹. I neuroner blev QMI brugt til at beskrive input-specifik omorganisering af et protein interaktions netværk for forskellige typer indgangssignaler på en måde, der understøtter nye modeller af synaptisk plasticitet¹⁷. Desuden, denne synaptisk QMI panel blev brugt til at identificere forskelle i syv musemodeller af autisme, klynge modellerne i undergrupper baseret på deres fiskene biosigna turer, og præcist hypotese en fælles molekylære underskud, der tidligere var ukendt i en af modellerne¹⁶. En lignende fremgangsmåde kan bruges til at screene for andre undergrupper, der kan reagere på forskellige lægemidler behandlinger, eller tildele narkotika til specifikke Responsive undergrupper. QMI har potentielle anvendelser i diagnostik, patient sub-Typing, og narkotika udvikling, ud over grundlæggende videnskab.

For at samle et QMI-antistof panel beskrives de indledende antistof screenings-og udvælgelses protokoller i afsnit 1 nedenfor. Når der er identificeret antistof paneler, er der i punkt 2 beskrevet protokoller for konjugering af de valgte antistoffer mod magnetiske perler for IP og for biotinylering af de valgte Probe antistoffer. Protokollen for at køre QMI-analysen på celle-eller vævs lysater er beskrevet i punkt 3. Endelig, da et enkelt eksperiment kan generere ~ 5 x 10⁵ individuelle datapoint, instruktioner og edb-koder til at hjælpe med databehandling, analyse og visualisering er angivet i afsnit 4. En oversigt over arbejdsprocessen, der er beskrevet i afsnit 2-4, er vist i figur 1.

Protocol

1. analyse design Forberedelse af kandidat antistof For hvert protein af interesse, Vælg 3 til 5 antistoffer til skærmen. Når det er muligt, skal du bruge monoklonale antistoffer, der genkender forskellige epitoper. Også omfatte et ikke-specifikt kontrol-antistof. For at fjerne Tris, udføre buffer udveksling ved at tilføje antistoffet til en 30 kDa spin filter, spinning ned til sin mindste volumen, tilføje 500 μL fosfat-bufferet saltvand (PBS), og gentage 3 gange. For at fjerne Carrie…

Representative Results

Antistof screeningFigur 2 B viser resultaterne af en skærm for proteinet Connexin36. De fleste IP_probe kombinationer giver ikke signal over IgG-kontrolelementer. IP med det monoklonale antistof 1E5 og sonde med enten 1E5 eller polyklonal antistof 6200 producerer et højre Skift i perle fordelingen sammenlignet med IgG-kontroller. Her blev IP 1E5 og Probe 6200poly udvalgt til at undgå at bruge det samme antistof som IP og sonde, både for at reducere s…

Discussion

QMI-analysen kræver betydelige investeringer i udvikling af antistof paneler, udstyr og reagenser, men når analysen er etableret, kan man indsamle højdimensionale data, der observerer protein interaktions netværk, når de reagerer på eksperimentelt kontrollerede Stimuli. Teknisk set kræver QMI omhyggelig pipettering og sporing af prøve-og antistof brønd placeringer. Omhyggeligt mærkning af analyse plader er nyttig, som gør en detaljeret skabelon af godt steder på papiret, som derefter gemmes til dataanalyse. B…

Materials

96-well flat bottomed plates	Bio Rad	171025001
96-well PCR plates	VWR	82006-704
Bioplex 200 System with HTF	Bio Rad	171000205	modiefied to keep partially refrigerated, see Figure S1 for details
Bio-Plex Pro Wash Station	Bio Rad	30034376
BSA	Sigma
CML beads	Invitrogen	C37481
EDTA	Sigma	E6758
EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin	Thermo Scientific	A39256
MagPlex Microspheres	Luminex	MC12xxx-01	xxx is the 3 digit bead region
Melon Gel IgG Spin Purification Kit	Thermo Scientific	45206	used for antibody purification
MES	Sigma	M3671
Microplate film, non-sterile	USA Scientific	2920-0000
Phosphotase inhibitor cocktail #2	Sigma	P5726
Protease inhibitor cocktail	Sigma	P8340
Sandwich Prep Refrigerator	Norlake	SMP 36 15	for custom refrigeration of Bioplex 200
Sodium fluoride	Sigma	201154
Sodium orthovanadate	Sigma	450243
Streptavidin-PE	BioLegend	405204
Sulfo NHS	Thermo Scientific	A39269
Tris	Fisher Scientific	BP152