Kwantificering van eiwit interactie netwerk dynamiek met Multiplexed co-immunoprecipitatie
Summary
Kwantitatieve multiplex Immunoprecipitation (QMI) gebruikt Flowcytometrie voor gevoelige detectie van verschillen in de overvloed van gerichte eiwit-eiwit interacties tussen twee monsters. QMI kan worden uitgevoerd met een kleine hoeveelheid biomateriaal, vereist geen genetisch gemanipuleerde Tags en kan worden aangepast voor elk eerder gedefinieerd proteïne-interactie netwerk.
Abstract
Dynamische eiwit-eiwit interacties beheersen cellulair gedrag, van beweeglijkheid tot DNA-replicatie tot signaaltransductie. Het monitoren van dynamische interacties tussen meerdere eiwitten in een proteïne-interactie netwerk is echter technisch moeilijk. Hier presenteren we een protocol voor kwantitatieve multiplex-immunoprecipitatie (QMI), dat kwantitatieve beoordeling van vouw veranderingen in eiwit interacties mogelijk maakt op basis van relatieve fluorescentie metingen van eiwitten in gedeelde complexen gedetecteerd door blootgestelde Oppervlakte epitopen (vissen). In QMI worden eiwitcomplexen van celllysates op microsferen immunoprecipitated en vervolgens gepropageerd met een gelabeld antilichaam voor een ander eiwit om de overvloed aan vissen te kwantificeren. Immunoprecipitation-antilichamen worden geconjugeerd aan verschillende MagBead-spectrale gebieden, waardoor een flow-cytometer meerdere parallelle immunoprecipitaties kan differentiëren en tegelijkertijd de hoeveelheid sonde-antilichamen die aan elk is gekoppeld, kwantificeren. QMI vereist geen genetische tagging en kan worden uitgevoerd met behulp van minimale biomateriaal in vergelijking met andere immunoprecipitatie-methoden. QMI kan worden aangepast voor elke gedefinieerde groep van de interactie eiwitten, en is tot nu toe gebruikt voor het karakteriseren van signalering netwerken in T-cellen en neuronale glutamaat synapsen. Resultaten hebben geleid tot nieuwe hypothese generatie met potentiële diagnostische en therapeutische toepassingen. Dit protocol bevat instructies voor het uitvoeren van QMI, vanaf de initiële selectie van het antilichaam-panel tot en met het uitvoeren van assays en het analyseren van gegevens. De initiële assemblage van een QMI-test omvat het screenen van antilichamen voor het genereren van een panel en het empirisch bepalen van een geschikte lysisbuffer. Het daaropvolgende reagens preparaat omvat covalent koppelen van immunoprecipitatie antilichamen tegen MagBeads, en biotinylating probe antilichamen, zodat ze kunnen worden gelabeld door een streptavidine-geconjugeerd fluorophore. Om de test uit te voeren, wordt lysaat ‘s nachts gemengd met magbeads, en vervolgens worden kralen verdeeld en geïntrigeerd met verschillende sonde-antilichamen, en vervolgens een de-label, en gelezen door flow cytometrie. Er worden twee statistische tests uitgevoerd om vissen te identificeren die significant verschillen tussen de experimentele omstandigheden, en de resultaten worden gevisualiseerd met behulp van Heatmaps of node-Edge diagrammen.
Introduction
Dynamische eiwit-eiwit interacties vormen de moleculaire signalering Cascades en beweeglijke structuren die de functionele basis van de meeste cellulaire fysiologie zijn1. Deze processen worden vaak afgebeeld als lineaire signalerings trajecten die schakelen tussen stabiele toestanden op basis van enkelvoudige ingangen, maar experimentele en modellerings gegevens tonen duidelijk aan dat ze functioneren als geïntegreerde netwerken2,3, 4. in het geval van G-eiwitten hebben verschillende receptoren vaak de mogelijkheid om hetzelfde g-eiwit te activeren, en een enkele receptor kan ook meer dan één type g-eiwit5,6activeren. Om het relatief kleine aantal G eiwit klassen specifiek te moduleren een breed scala van cellulaire functies zoals synaptische transmissie, hormoon regulatie, en Celmigratie, cellen moeten beide integreren en differentiëren deze signalen4 , 5. uit bewijsmateriaal is gebleken dat de specificiteit van dit signaal, zowel voor G-eiwitten als voor anderen, primair wordt afgeleid op basis van fijn afgestemde eiwit-eiwit interacties en hun temporele dynamiek1,3, 4 , 5 , 6 , 7. omdat signalerings netwerken bestaan uit dynamische eiwitcomplexen met meerdere ingangen, outputs en feedbacklussen, heeft één enkele perturbatie de mogelijkheid om het algemene homeostatische evenwicht van de Fysiologie van een cel te veranderen4 ,7. Het is nu algemeen overeengekomen dat signalering vanuit een netwerk perspectief moet worden onderzocht om beter te begrijpen hoe de integratie van meerdere ingangen discrete cellulaire functies regelt in gezondheid en ziekte7,8, 9,10,11,12,13. In het licht hiervan werd kwantitatieve multiplex Immunoprecipitation (QMI) ontwikkeld om middelmatige doorvoer te verzamelen, kwantitatieve gegevens over vouw veranderingen in dynamische proteïne-interactie netwerken.
QMI is een op antilichamen gebaseerde test waarbij cellysaat wordt geïnineerd met een panel van immunoprecipitatie-antilichamen die covalent zijn gekoppeld aan magnetische kralen met duidelijke verhoudingen van fluorescerende kleurstoffen. Het hebben van specifieke antilichamen gekoppeld aan verschillende magnetische kraal klassen zorgt voor gelijktijdige co-immunoprecipitatie van meerdere doel eiwitten uit hetzelfde lysaat. Na immunoprecipitatie (IP) worden magnetische kralen geïnfiltreerd met een tweede, fluorophore-geconjugeerd sonde antilichaam (of biotinyleerd antilichaam in combinatie met fluorophore-geconjugeerde streptavidin). Co-associaties tussen de eiwitten die worden herkend door elk IP-antilichaam-sonde antilichaam paar, of vissen (eiwitten in gedeelde complexen gedetecteerd door blootgestelde oppervlak Epitopes), worden vervolgens gedetecteerd door Flowcytometrie en kunnen kwantitatief worden vergeleken tussen verschillende voorwaarden14. Illustraties in Figuur 1 tonen de stappen die betrokken zijn bij het uitvoeren van een QMI-test, waaronder een diagram van magnetische parels met immunoprecipitated proteïne complexen gelabeld door fluorescently geconjugeerde sonde-antilichamen (Figuur 1C).
De gevoeligheid van QMI is afhankelijk van de eiwitconcentratie van het lysaat ten opzichte van het aantal magnetische kralen dat wordt gebruikt voor immunoprecipitatie, en het bereiken van een resolutie voor het detecteren van 10% vouw veranderingen vereist slechts een kleine hoeveelheid startmateriaal in vergelijking met andere Co-IP-methoden14,15. De hoeveelheid uitgangsmateriaal die wordt gebruikt in QMI is bijvoorbeeld vergelijkbaar met die welke vereist is voor een sandwich-enzym-linked ImmunoSorbent assay (ELISA), maar er worden meerdere interacties gedetecteerd in één QMI-test. QMI assays met behulp van 20 IPs en 20 sonde targets zijn uitgevoerd met behulp van 1-5 x 105 primaire T-cellen geïsoleerd uit een 4 mm huid biopsie, P2 synaptosomale preparaten uit een 3 mm coronale sectie van muis prefrontale cortex, of 3 x 106 gekweekte muis primaire corticale neuronen14,16,17. Deze gevoeligheid maakt QMI nuttig voor analyse van cellen of weefsel met beperkte beschikbaarheid, zoals klinische monsters.
QMI kan worden aangepast voor elk eerder gedefinieerd proteïne-interactie netwerk (op voorwaarde dat antilichamen beschikbaar zijn), en tot op heden is ontwikkeld om de T Cell antigen receptor (TCR) signalosome te analyseren en een subset van eiwitten bij glutamaterge synapsen in neuronen 17 , 18. in studies van T Cell receptor signalering werd QMI voor het eerst gebruikt om stimulatie veroorzaakte veranderingen in vissen te identificeren, en vervolgens om auto-immuunpatiënten van een controlegroep te onderscheiden, endogene auto-immuunsigna lering te detecteren en tot slot een hypothese met betrekking tot een onevenwichtige ziekte-geassocieerde subnetwerk van interacties14. Meer recentelijk werd hetzelfde QMI-panel gebruikt om te bepalen dat de selectie van thymocyte wordt bepaald door kwantitatieve, in plaats van kwalitatieve verschillen in TCR-geassocieerde proteïne-signalering19. In neuronen werd QMI gebruikt om input-specifieke herschikking van een proteïne-interactie netwerk te beschrijven voor verschillende typen ingangssignalen op een manier die nieuwe opkomende modellen van synaptische plasticiteit17ondersteunt. Bovendien, dit synaptische QMI panel werd gebruikt om de verschillen in zeven Muismodellen van autisme identificeren, cluster de modellen in subgroepen op basis van hun vissen biosignatures, en nauwkeurig veronderstellen een gedeeld moleculair tekort dat voorheen niet werd herkend in een van de modellen16. Een soortgelijke benadering kan worden gebruikt om te schermen voor andere subgroepen die kunnen reageren op verschillende medicamenteuze behandelingen, of om drugs toe te wijzen aan specifieke responsieve subgroepen. QMI heeft potentiële toepassingen in diagnostiek, het ondertypen van patiënten en de ontwikkeling van geneesmiddelen, naast de basiswetenschap.
Om een QMI-antilichaam paneel samen te stellen, worden de eerste antilichamen screening en selectie protocollen beschreven in sectie 1 hieronder. Wanneer antilichamen worden geïdentificeerd, worden de protocollen voor conjugatie van de geselecteerde antilichamen tegen magnetische kralen voor IP en voor biotinylatie van de geselecteerde antilichamen van de sonde beschreven in rubriek 2. Het protocol voor het uitvoeren van de QMI-test op cel-of weefsel lysaten wordt beschreven in rubriek 3. Ten slotte, omdat een enkel experiment kan genereren ~ 5 x 105 individuele data Points, instructies en computercodes om te helpen bij de verwerking van gegevens, analyse en visualisatie worden gegeven in sectie 4. Een overzicht van de werkstroom die wordt beschreven in secties 2-4 wordt weergegeven in Figuur 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
De QMI-test vereist substantiële investeringen in de ontwikkeling, apparatuur en reagentia van het antilichaam paneel, maar zodra de test is vastgesteld, kan men hoogdimensionale gegevens verzamelen die de proteïne-interactie netwerken observeren terwijl ze reageren op experimentaal gecontroleerde stimuli. Technisch vereist QMI zorgvuldige Pipetteer-en traceer controle van monster-en antilichaam goed locaties. Zorgvuldig labelen van de test platen is nuttig, zoals het maken van een gedetailleerd sjabloon van goed locat…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen tessa Davis erkennen voor belangrijke bijdragen aan de ontwikkeling van QMI Assay, en aan huidige en voormalige leden van de laboratoria Smith en Schrum voor technische begeleiding en intellectuele input. Dit werk werd gefinancierd door NIMH subsidies R01 MH113545 en R00 MH 102244.
Materials
| 96-well flat bottomed plates | Bio Rad | 171025001 | |
| 96-well PCR plates | VWR | 82006-704 | |
| Bioplex 200 System with HTF | Bio Rad | 171000205 | modiefied to keep partially refrigerated, see Figure S1 for details |
| Bio-Plex Pro Wash Station | Bio Rad | 30034376 | |
| BSA | Sigma | ||
| CML beads | Invitrogen | C37481 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin | Thermo Scientific | A39256 | |
| MagPlex Microspheres | Luminex | MC12xxx-01 | xxx is the 3 digit bead region |
| Melon Gel IgG Spin Purification Kit | Thermo Scientific | 45206 | used for antibody purification |
| MES | Sigma | M3671 | |
| Microplate film, non-sterile | USA Scientific | 2920-0000 | |
| Phosphotase inhibitor cocktail #2 | Sigma | P5726 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| Sandwich Prep Refrigerator | Norlake | SMP 36 15 | for custom refrigeration of Bioplex 200 |
| Sodium fluoride | Sigma | 201154 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma | 450243 | |
| Streptavidin-PE | BioLegend | 405204 | |
| Sulfo NHS | Thermo Scientific | A39269 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP152 |
Riferimenti
- Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes and Development. 14 (9), 1027-1047 (2000).
- Rodríguez-Jorge, O., et al. Cooperation between T cell receptor and Toll-like receptor 5 signaling for CD4. Science Signaling. 12 (577), (2019).
- Bugaj, L. J., et al. Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway. Science. 361 (6405), (2018).
- Pawson, T. Dynamic control of signaling by modular adaptor proteins. Current Opinion in Cell Biology. 19 (2), 112-116 (2007).
- Hamm, H. E. The many faces of G protein signaling. Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 669-672 (1998).
- Lohse, M. J., Hofmann, K. P. Spatial and Temporal Aspects of Signaling by G-Protein-Coupled Receptors. Molecular Pharmacology. 88 (3), 572-578 (2015).
- Eltschinger, S., Loewith, R. TOR Complexes and the Maintenance of Cellular Homeostasis. Trends in Cell Biology. 26 (2), 148-159 (2016).
- Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (2), 99-111 (2005).
- Komarova, N. L., Zou, X., Nie, Q., Bardwell, L. A theoretical framework for specificity in cell signaling. Molecular Systems Biology. 1, 23 (2005).
- Schrum, A. G., Gil, D. Robustness and Specificity in Signal Transduction via Physiologic Protein Interaction Networks. Clinical and Experimental Pharmacology. 2 (3), (2012).
- De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Computational Biology. 6 (6), 1000807 (2010).
- Ron, D., Walter, P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (7), 519-529 (2007).
- Bogdan, A. R., Miyazawa, M., Hashimoto, K., Tsuji, Y. Regulators of Iron Homeostasis: New Players in Metabolism, Cell Death, and Disease. Trends in Biochemical Sciences. 41 (3), 274-286 (2016).
- Smith, S. E., et al. Multiplex matrix network analysis of protein complexes in the human TCR signalosome. Science Signaling. 9 (439), 7 (2016).
- Schrum, A. G., et al. High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Science’s STKE. 2007 (389), (2007).
- Brown, E. A., et al. Clustering the autisms using glutamate synapse protein interaction networks from cortical and hippocampal tissue of seven mouse models. Molecular Autism. 9 (1), 48 (2018).
- Lautz, J. D., Brown, E. A., Williams VanSchoiack, A. A., Smith, S. E. P. Synaptic activity induces input-specific rearrangements in a targeted synaptic protein interaction network. Journal of Neurochemistry. 146 (5), 540-559 (2018).
- Smith, S. E., et al. Signalling protein complexes isolated from primary human skin-resident T cells can be analysed by Multiplex IP-FCM. Experimental Dermatology. 23 (4), 272-273 (2014).
- Neier, S. C., et al. The early proximal αβ TCR signalosome specifies thymic selection outcome through a quantitative protein interaction network. Science Immunology. 4 (32), (2019).
- Davis, T. R., Schrum, A. G. IP-FCM: immunoprecipitation detected by flow cytometry. Journal of Visualized Expiriments. (46), (2010).
- Smith, S. E., et al. IP-FCM measures physiologic protein-protein interactions modulated by signal transduction and small-molecule drug inhibition. PLoS One. 7 (9), 45722 (2012).
- Lautz, J., et al. Activity-dependent changes in synaptic protein complex composition are consistent in different detergents despite differential solubility. BioRXiv. , (2019).
- Langfelder, P., Horvath, S. WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis. BMC Bioinformatics. 9, 559 (2008).
- Schrum, A. G., Gil, D., Turka, L. A., Palmer, E. Physical and functional bivalency observed among TCR/CD3 complexes isolated from primary T cells. Journal of Immunology. 187 (2), 870-878 (2011).
