멀티플렉스 동시 면역 침전을 이용한 단백질 상호 작용 네트워크 역학의 정량화
Summary
정량적 멀티플렉스 면역침전(QMI)은 두 샘플 간의 표적 단백질-단백질 상호 작용의 풍부성에 대한 민감한 검출을 위해 유세포분석기를 사용합니다. QMI는 소량의 생체 물질을 사용하여 수행될 수 있고, 유전자 조작 태그를 필요로 하지 않으며, 이전에 정의된 단백질 상호작용 네트워크에 적응될 수 있다.
Abstract
동적 단백질-단백질 상호 작용 제어 세포 행동, 운동성에서 DNA 복제 신호 변환에. 그러나, 단백질 상호 작용 네트워크에서 여러 단백질 간의 동적 상호 작용을 모니터링하는 것은 기술적으로 어렵습니다. 여기에서, 우리는 노출에 의해 검출된 공유 복합체에 있는 단백질의 상대적인 형광 측정에 근거를 둔 단백질 상호 작용에 있는 배 변경의 정량적인 평가를 허용하는 정량적 멀티플렉스 면역 침전 (QMI)를 위한 프로토콜을 제시합니다 표면 에피토프 (PiSCES). QMI에서, 세포 용해물에서 단백질 복합체는 PiSCES의 풍부를 정량화하기 위하여 다른 단백질을 위한 표지된 항체로 그 때 마이크로스피어로 면역 침전되고, 그 때 조사됩니다. 면역 침전 항체는 다른 MagBead 스펙트럼 지구에 공액화되어 유동 세포계가 다중 병렬 면역 침전을 분화하고 동시에 각각과 관련된 프로브 항체의 양을 정량화할 수 있습니다. QMI는 유전 적 태깅을 필요로하지 않으며 다른 면역 침전 방법에 비해 최소한의 생체 재료를 사용하여 수행 할 수 있습니다. QMI는 상호 작용하는 단백질의 임의의 정의된 단에 적응될 수 있고, 지금까지 T 세포 및 신경 글루타메이트 시냅스에서 신호 네트워크를 특성화하는 데 사용되어 왔다. 결과는 잠재적인 진단 및 치료 응용을 가진 새로운 가설 생성으로 이끌어 냈습니다. 이 프로토콜에는 초기 항체 패널 선택부터 실행 분석 및 데이터 분석에 이르기까지 QMI를 수행하는 지침이 포함되어 있습니다. QMI 분석법의 초기 조립은 패널을 생성하는 스크리닝 항체를 포함하고, 경험적으로 적절한 라시스 완충액을 결정한다. 후속 시약 제제는 MagBeads에 면역 침전 항체를 공유결합하고, 생물항제 프로브 항체를 포함하므로 스트렙타비딘-컨쥬게이트 형광에 의해 표지될 수 있다. 분석기를 실행하기 위해, 매사염은 하룻밤 동안 MagBeads와 혼합된 다음, 구슬을 다른 프로브 항체로 분할 및 배양한 다음, 불소 라벨을, 및 유세포 분석으로 읽습니다. 두 가지 통계 테스트가 수행되어 실험 조건간에 크게 다른 PiSCES를 식별하며, 히트맵 또는 노드 에지 다이어그램을 사용하여 결과를 시각화합니다.
Introduction
동적 단백질-단백질 상호 작용은 대부분의 세포 생리학1의 기능적 기초인 분자신호 캐스케이드 및 운동성 구조를 구성한다. 이러한 프로세스는 종종 단일 입력을 기반으로 정상 상태 사이를 전환하는 선형 신호 경로로 묘사되지만 실험 및 모델링 데이터는 통합 네트워크 2,3 . 4.G 단백질의 경우, 다른 수용체는 종종 동일한 G 단백질을 활성화할 수 있으며, 단일 수용체는또한 G 단백질 5,6의한 가지 유형 이상을 활성화시킬 수 있다. 상대적으로 적은 수의 G 단백질 클래스가 시냅스 전송, 호르몬 조절 및 세포 이동과 같은 광범위한 세포 기능을 구체적으로 조절하기 위해서는 세포가 이러한 신호를 통합하고 분화해야 합니다4 , 5. 증거는 이 신호 특이성이 G 단백질뿐만 아니라 다른 사람에 대해, 주로 미세 조정 된 단백질 – 단백질 상호 작용 및 시간 역학 1,3에기초하여 파생된다는 것을 보여주었습니다. 4개 , 5개 , 6개 , 7. 시그널링 네트워크는 여러 입력, 출력 및 피드백 루프가있는 동적 단백질 복합체로 구성되기 때문에 단일 섭동은 세포의 생리학4의 전반적인 적시 성 균형을 변경할 수있는 기회를 가합니다. ,7. 이제 여러 입력의 통합이 건강과 질병7,8에서개별 세포 기능을 제어하는 방법을 더 잘 이해하기 위해 네트워크 관점에서 신호를 검사해야한다는 것이 널리 동의됩니다. 9,10,11,12,13. 이에 비추어, 정량적 멀티플렉스 면역침전(QMI)은 동적 단백질 상호작용 네트워크의 배 변화에 대한 중간 처리량, 정량적 데이터를 수집하기 위해 개발되었다.
QMI는 세포 용해가 형광 염료의 뚜렷한 비율을 포함하는 자기 구슬에 공유결합되는 면역 침전 항체의 패널로 배양되는 항체 기지를 둔 분석입니다. 뚜렷한 자기 비드 클래스에 결합된 특정 항체를 갖는 것은 동일한 용해물로부터 다중 표적 단백질의 동시 동시 동시 면역 침전을 허용한다. 면역 침전 (IP)에 이어, 자기 비드는 두 번째, 형광 공형 프로브 항체 (또는 플루오로포폴화 된 스트렙타비딘과 함께 생체 면역 항체)로 배양됩니다. 각 IP 항체 프로브 항체 쌍또는 PiSCES (노출된 표면 에피토프에 의해 검출된 공유 복합체의 단백질)에 의해 인식된 단백질 간의 공동 연결은 유세포 측정에 의해 검출되고 서로 다른 사이에서 정량적으로 비교될 수 있습니다. 샘플 조건14. 도 1의 그림은 형광공응접체 프로브 항체에 의해 표지된 면역침전성 단백질 복합체를 가진 자기 비드의 다이어그램을 포함하여 QMI 분석을 실행하는 데 관여하는 단계를 보여 준다(도1C).
QMI의 감도는 면역 침전에 사용되는 자기 비드의 수에 비해 용해물의 단백질 농도에 따라 달라지며, 10% 배 변화를 검출하는 분해능을 달성하는 것은 다른 것에 비해 소량의 시작 물질만필요로 한다. 공동 IP 방법14,15. 예를 들어, QMI에 사용되는 시작 물질의 양은 샌드위치 효소 연계 면역흡착 분석(ELISA)에 필요한 것과 유사하지만, 단일 QMI 분석에서 여러 상호작용이 검출된다. 20개의 IP 및 20개의 프로브 표적을 사용하여 QMI 표적은 4 mm 피부 생검으로부터 분리된 1-5 x 10 5차 T 세포를 사용하여 수행되었으며, P2 시냅소탈 제제는 마우스 전두엽 피질의 3 mm 관상 동맥 부편에서, 또는 3 x 106 배양 마우스 프라이머리를 사용하여 수행되었다. 피질 뉴런14,16,17. 이 감도는 임상 견본과 같은 제한된 가용성을 가진 세포 또는 조직의 분석을 위해 QMI를 유용하게 합니다.
QMI는 이전에 정의된 단백질 상호작용 네트워크(항체가 사용 가능)에 대해 적응할 수 있으며, 현재까지 뉴런의 글루타마테르지시냅스에서 T 세포 항원 수용체(TCR) 신호체 및 단백질의 서브세트를 분석하기 위해 개발되었습니다. 17세 , 18.T 세포 수용체 신호의 연구에서, QMI는 먼저 PiSCES에서 자극 유발 변화를 식별하기 위해 사용되었다, 다음 대조군에서 자가 면역 환자를 구별하기 위해, 내인성 자가 면역 신호를 감지하고, 마지막으로 생성하는 상호 작용의 불균형 질병 관련 하위 네트워크와 관련된 가설14. 보다 최근에는 동일한 QMI 패널이 TCR 관련 단백질 신호(19)의 질적 차이보다는 정량적차이에 의해 결정되는 흉선 선택이 결정되는 것을 결정하는데 사용되었다. 뉴런에서, QMI는 시냅스 가소성17의새롭게 떠오르는 모델을 지원하는 방식으로 뚜렷한 유형의 입력 신호에 대한 단백질 상호작용 네트워크의 입력 특이적 재배열을 설명하는 데 사용되었다. 또한, 이 시냅스 QMI 패널은 자폐증의 7개의 마우스 모델에서 차이를 식별하고, PiSCES 생체 서명을 기반으로 모델을 하위 그룹으로 클러스터화하고, 이전에는 인식되지 않았던 공유 분자 적자를 정확하게 가설하는 데 사용되었습니다. 모델 16중 하나에서 . 유사한 접근은 다른 약 처리에 반응할 수 있는 그밖 소집단을 위해 가리기 위하여 이용될 수 있었습니다, 또는 특정 반응하는 하위 단에 약을 할당하. QMI는 기초 과학 이외에 진단, 환자 서브 타이핑 및 약물 개발에 잠재적인 응용 프로그램을 가지고 있습니다.
QMI 항체 패널을 조립하기 위해, 초기 항체 스크리닝 및 선택 프로토콜은 아래 섹션 1에 기재되어 있다. 항체 패널이 확인되면, IP를 위한 자기 비드에 선택된 항체의 컨쥬게이션을 위한 프로토콜, 그리고 선택된 프로브 항체의 생체 측질화를 위한, 섹션 2에서 기술된다. 세포 또는 조직 용해에 대한 QMI 분석을 실행하기 위한 프로토콜은 섹션 3에 기재되어 있다. 마지막으로 단일 실험에서는 ~5 x105개의 개별 데이터 포인트를 생성할 수 있기 때문에 데이터 처리, 분석 및 시각화를 지원하는 지침과 컴퓨터 코드가 섹션 4에 제공됩니다. 2-4절에 설명된 워크플로의 개요는 그림1에 나와 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
QMI 분석법은 항체 패널 개발, 장비 및 시약에 상당한 투자가 필요하지만, 일단 분석이 확립되면 실험적으로 제어되는 단백질 상호 작용 네트워크를 관찰하는 고차원 데이터를 수집할 수 있습니다. 자극. 기술적으로 QMI는 시료 및 항체 유정 위치의 신중한 파이펫팅 및 추적이 필요합니다. 분석 판에 신중하게 라벨을 붙이는 것은 종이에 우물 위치의 상세한 템플릿을 만드는 것과 같이 유용하며, 이?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 QMI 분석 개발에 중요한 기여에 대한 테사 데이비스를 인정하고 자합니다, 기술 지도 및 지적 입력스미스와 슈럼 연구소의 현재와 전 회원. 이 작품은 NIMH 보조금 R01 MH113545 및 R00 MH 102244에 의해 지원되었다.
Materials
| 96-well flat bottomed plates | Bio Rad | 171025001 | |
| 96-well PCR plates | VWR | 82006-704 | |
| Bioplex 200 System with HTF | Bio Rad | 171000205 | modiefied to keep partially refrigerated, see Figure S1 for details |
| Bio-Plex Pro Wash Station | Bio Rad | 30034376 | |
| BSA | Sigma | ||
| CML beads | Invitrogen | C37481 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin | Thermo Scientific | A39256 | |
| MagPlex Microspheres | Luminex | MC12xxx-01 | xxx is the 3 digit bead region |
| Melon Gel IgG Spin Purification Kit | Thermo Scientific | 45206 | used for antibody purification |
| MES | Sigma | M3671 | |
| Microplate film, non-sterile | USA Scientific | 2920-0000 | |
| Phosphotase inhibitor cocktail #2 | Sigma | P5726 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| Sandwich Prep Refrigerator | Norlake | SMP 36 15 | for custom refrigeration of Bioplex 200 |
| Sodium fluoride | Sigma | 201154 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma | 450243 | |
| Streptavidin-PE | BioLegend | 405204 | |
| Sulfo NHS | Thermo Scientific | A39269 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP152 |
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