Summary
यहां, हम वयस्क चूहों में संक्रमण के एक intracisternal मार्ग के माध्यम से मेनिंगोकोकल मेनिनजाइटिस प्रेरित करने के लिए एक विधि का वर्णन. हम intracisternal संक्रमण के लिए inoculum की तैयारी से मेनिंगोकोकल संक्रमण के कदम प्रोटोकॉल द्वारा एक कदम पेश; फिर पशु अस्तित्व रिकॉर्ड और murine ऊतकों में जीवाणु भार का मूल्यांकन.
Abstract
नेसेरिया मेनिंगिटिस (मेनिंगोकोकस) एक संकीर्ण मेजबान-रेंज सूक्ष्मजीव है, जिसे विश्व स्तर पर बैक्टीरियल मैनिंजाइटिस के प्रमुख कारण के रूप में मान्यता प्राप्त है। मेनिंगोकोकस स्वस्थ विषय के लगभग 10% के मानव नासोफैरिक्स का एक क्षणिक कॉलोनाइजर है। विशेष परिस्थितियों में, यह mucosal बाधा घुसना करने के लिए एक आक्रामक क्षमता प्राप्त करता है और सेप्टिकेमिया के कारण खून पर आक्रमण. नवीनतम मामले में, मैनिजिनाइटिस के परिणामी विकास के बिना भी फुलमिनिंग सेप्सिस उत्पन्न हो सकता है। इसके विपरीत, बैक्टीरिया खराब खून में गुणा कर सकता है, रक्त मस्तिष्क बाधा पार, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र तक पहुँचने, fulminant दिमागी शोहकरने के लिए अग्रणी. बैक्टीरियल मैनिंजाइटिस के murine मॉडल मेजबान-रोगजनक बातचीत की जांच करने के लिए और इस घातक बीमारी के लिए जिम्मेदार रोगजनक तंत्र का विश्लेषण करने के लिए एक उपयोगी उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं। हालांकि, कई प्रयोगात्मक मॉडल प्रणालियों पिछले दशकों में मूल्यांकन किया गया है, इनमें से कोई भी मेनिंगोकोकल रोग की विशेषता रोग घटनाओं को पुन: पेश करने में सक्षम थे. इस प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल में, हम बैक्टीरिया के intracisternal टीका के आधार पर एक माउस मॉडल में मेनिंगोकोकल मेनिनजाइटिस के प्रेरण के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया का वर्णन. मानव मैनिंजाइटिस के अजीब संकेत नैदानिक मापदंडों (जैसे, तापमान, शरीर के वजन), जीवित रहने की दर का मूल्यांकन, सूक्ष्मजीवी विश्लेषण और मस्तिष्क की चोट की हिस्टोलॉजिकल परीक्षा के आकलन के माध्यम से murine मेजबान में दर्ज किए गए थे। intracisternal (i.cist.) inoculum का उपयोग करते समय, मेनिंगोकोसी पूर्ण वितरण सीधे सिस्टर्ना मैग्नामें, मस्तिष्क के ऊतकों में एक बहुत ही कुशल मेनिंगोकोकल प्रतिकृति के लिए अग्रणी। लगभग 18 ज में बैक्टीरिया की व्यवहार्य संख्या में 1,000 गुना वृद्धि देखी गई है। इसके अलावा, मेनिंगोकोसी भी तिल्ली में पाए जाते हैं, और संक्रमित चूहों के जिगर, सुझाव है कि जिगर मेनिंगोकोकल प्रतिकृति के लिए एक लक्ष्य अंग का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं.
Introduction
नेसेरिया मेनिंगिटिस एक ग्राम नकारात्मक है - प्रोटीओबैक्टीरियम मानव मेजबान तक ही सीमित है, जो दुनिया भर में मानव आबादी में मेनिनजाइटिस और सेप्सिस के सबसे आम कारणों में से एक होने के लिए जाना जाता है। यह स्वस्थ और स्पर्शोन्मुख वाहक (2-30% आबादी) के ऊपरी श्वसन पथ (नोज और गले) को उपनिवेश करता है, लेकिन जीवाणु कभी-कभी विभिन्न मेजबान प्रतिरक्षा सुरक्षा से बच जाता है और खून से मस्तिष्क तक फैलता है जिससे एक अनियंत्रित स्थानीय सूजन, मेनिंगोकोकल मेनिनजाइटिस के रूप में जाना जाता है। मेजबान और जीवाणु कारकों का एक संयोजन आक्रामक व्यवहार1को commensal से संक्रमण के लिए योगदान करने के लिए प्रकट होता है.
एन मेनिंगटिडिस विशेष रूप से मानव उपनिवेशन और संक्रमण में विशेष है। यह एक संकीर्ण मेजबान रेंज है और, इसलिए, मानव मेनिंगोकोकल रोग को पुन: उत्पन्न करने वाले उपयुक्त पशु मॉडल की कमी के कारण विवो रोगजनन अध्ययन में सीमित है। नतीजतन, यह मेनिंगोकोकस के कारण सेप्टिकेमिया और मेनिनजाइटिस के रोगजनन से संबंधित समझ में बुनियादी अंतराल के लिए नेतृत्व किया था। पिछले दशकों में , कई इन विट्रो प्रणालियों के विकास ने कई मेनिंगोकोकल उग्रता कारकों की पहचान की अनुमति दी2,3,4. हालांकि इन मूल्यवान अध्ययन एक सफल मेनिंगोकोकल संक्रमण के लिए इन कारकों की भूमिका को समझने के लिए महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की, इन मॉडलों हास्य और सेलुलर के साथ जीवाणु बातचीत के परिणामों के आकलन की अनुमति नहीं दी प्रतिरक्षा प्रणाली और पूरे ऊतक के साथ भी कम. विवो पशु में संक्रमण के मॉडल महान प्रासंगिकता के रूप में अच्छी तरह से टीका योगों द्वारा प्रदत्त संरक्षण की डिग्री के मूल्यांकन के लिए कर रहे हैं. एक मानव-उष्णकटिबंधीय रोगजनक के रूप में, मेनिंगोकोकस में सतह संरचनाओं (यानी, टाइप IV पिली और अस्पष्टता प्रोटीन) और मानव रिसेप्टर्स और परिवहन प्रोटीन के लिए लोहे की तेज प्रणाली जैसे सफल संक्रमण के लिए आवश्यक उचित निर्धारक ों का अधिकारी होता है (यानी, transferrin और lactoferrin)5,6,7 ठीक से पालन करने के लिए, जीवित है और मानव मेजबान पर आक्रमण. अंत में, रोगज़नक़ की आनुवंशिक भिन्नता क्षमताओं से बचने के लिए और / या मानव प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया ब्लॉक आगे उच्च प्रजातियों tropism8,9के लिए योगदान . इसलिए, विशिष्ट मेजबान कारकों की अनुपस्थिति, बातचीत में शामिल, रोगजनक के जीवन चक्र के चरणों को ब्लॉक कर सकती है, मेनिंगोकोकल जीवन चक्र का सारांश देने वाले छोटे पशु मॉडलों के विकास में महत्वपूर्ण कठिनाइयों को स्थापित कर सकती है।
पिछले दशकों में, मेनिंगोकोकल संक्रामक चक्र की हमारी समझ में सुधार करने के लिए कई दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं। दो पशु मॉडल, माउस और चूहे के संक्रमण, या तो इंट्रापेरिटोनली (आई.पी.) या अंत:प्र.) (i.n.), मेनिंगोकोकल रोग10,11,12,13,14 को पुन: उत्पन्न करने के लिए विकसित किए गए थे ,15,16,17. प्रयोगशाला माउस शायद प्रयोगात्मक मेनिंगोकोकल संक्रमण को प्रेरित करने के लिए अधिक बहुमुखी जानवरों में से एक है।
हालांकि, संक्रमण का आई.पी. तरीका गंभीर सेप्सिस के विकास की ओर जाता है, हालांकि यह संक्रमण के प्राकृतिक मार्ग की नकल नहीं करता है, जबकि संक्रमण का आई.एन. मार्ग मेनिंगोकोकल रोगजनन का मूल्यांकन करने के लिए उपयोगी था, भले ही यह फेफड़ों के संक्रमण को प्रेरित कर सकता है सेप्सिस से पहले10,11,12,13,14, 15,16,17.
आई . पी . माउस मॉडल ने मेनिंगोकोकल चैलेंज10,11,12से सुरक्षा का आकलन करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई थी . संक्रमण के i.n. मार्ग पर आधारित मेनिंगोकोकल उपनिवेशन के माउस मॉडल शिशु चूहों के साथ विकसित किया गया है, क्योंकि वे मेनिंगोकोकी के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, मनुष्यों में मेनिंगोकोकल रोग के पाठ्यक्रम की नकल करने वाले एक आक्रामक संक्रमण को पुन: पेश करने के लिए 13,14,15,16,17. इसके अलावा, murine मेजबान में मेनिंगोकोकल प्रतिकृति को बढ़ावा देने के लिए, संक्रमण में सुधार करने के लिए जानवरों के लिए लोहे के प्रशासन सहित तकनीकी रणनीतियों की बढ़ती संख्या भी लागू की गई, उच्च जीवाणु inoculumके उपयोग , चूहे से गुजरने वाले जीवाणु तनाव के साथ-साथ शिशु या प्रतिरक्षा पशु के रोजगार के लिए10,13,15,18,19की मेजबानी की जाती है । CD4620 या transferrin21 जैसे विशिष्ट मानव कारकों की अभिव्यक्ति इस मानव-tropic जीवाणु के लिए चूहों की संवेदनशीलता में वृद्धि हुई है; संक्रमण के मानव त्वचा xenograft मॉडल का रोजगार भी मानव endothelium22,23के लिए meningococi के आसंजन क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए उपयोगी रहा है . सामूहिक रूप से, मानवीकृत ट्रांसजेनिक चूहों के हाल के विकास ने मेनिंगोकोकल रोगजनन और इसके मेजबान बातचीत की समझ में सुधार किया है।
इससे पहले, हमने मेनिंगोकोकल मेनिनजाइटिस का एक मौरीन मॉडल विकसित किया था जहां चूहे-पास ्डजीवाणुओंके साथ वयस्क चूहों के कुंडमें में बैक्टीरिया का टीका लगाया गया था। नैदानिक मानकों और संक्रमित चूहों के जीवित रहने की दर मानव मेजबान में देखा उन लोगों के लिए तुलनीय विशेषताओं के साथ दिमागी पनकी की स्थापना का प्रदर्शन किया, साथ ही, मस्तिष्क के सूक्ष्मजीवी और हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण. इन संक्रमित चूहों से, बैक्टीरिया, भी, रक्त, जिगर, और तिल्ली से बरामद किया गया, और परिधीय अंगों से जीवाणु भार संक्रामक खुराक के साथ सहसंबद्ध. विशेष रूप से, इस मॉडल को एल-ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर GltT24में दोषपूर्ण एक isogenic उत्परिवर्ती तनाव की उग्रता का मूल्यांकन करने के लिए नियोजित किया गया था। हाल ही में, आई.सी.टी. के आधार पर मेनिंगोकोकल मेनिनजाइटिस के हमारे माउस मॉडल का उपयोग करना। सीरोग्रुप सी तनाव के साथ मार्ग 93/42862,24 और एक isogenic उत्परिवर्ती यूडीपी के लिए सीएसए जीन एन्कोडिंग में दोषपूर्ण-एन-एसिटिलग्लूकोसामाइन 2-एपिमेरेज़25, हम स्थापना में उजागर sialic एसिड की भूमिका का विश्लेषण किया है चूहों में रोग की.
इस प्रोटोकॉल में, हम i.cist के आधार पर प्रयोगात्मक मेनिंगोकोकल मेनिनजाइटिस प्रेरित करने के लिए एक सरल विधि का वर्णन करते हैं। Balb/c वयस्क चूहों में संक्रमण का मार्ग. यह विधि विशेष रूप से एक murine मेजबान में मेनिंगोकोकल संक्रमण की विशेषता के लिए उपयोगी है, साथ ही जंगली प्रकार संदर्भ उपभेदों और isogenic उत्परिवर्ती के बीच उग्रता के आकलन के लिए. संक्रमण का इंट्रा-सिस्टरल मार्ग सीधे सिस्टर्ना मैग्ना में मेनिंगोकोसी की पूरी डिलीवरी सुनिश्चित करता है, जो बदले में मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) में जीवाणु प्रतिकृति की सुविधा प्रदान करता है और मेनिनजाइटिस को उन विशेषताओं के साथ प्रेरित करता है जो उन की नकल करते हैं। मनुष्यों में वर्तमान2,24,25,26.
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Protocol
यह प्रोटोकॉल पशु पीड़ा को कम करने और 24 नवंबर 1986 (86/609/EEC) के यूरोपीय समुदाय परिषद के निर्देश के अनुसार चूहों की संख्या को कम करने के लिए आयोजित किया गया था। इस अध्ययन में रिपोर्ट किए गए विवो प्रयोगों में एथिकल एनिमल केयर एंड यूज कमेटी (प्रोट. नंबर 2, 14 दिसंबर 2012) और इतालवी स्वास्थ्य मंत्रालय (प्रोट. संख्या 0000094-ए-03/ सभी प्रक्रियाओं Biosafety कैबिनेट 2 (BSC2) के अंदर एक BSL2 कमरे में प्रदर्शन किया जाना चाहिए, और संभावित संक्रमित अपशिष्ट समर्पित कंटेनरों में निपटा दिया जाना चाहिए.
1. एन मेनिंगटिडिस सेरोग्रुप सी तनाव के साथ चूहे का संक्रमण
चेतावनी: एन मेनिंगटिडिस संभावित रूप से एक हानिकारक रोगजनक है और इस सूक्ष्मजीव से निपटने के दौरान सभी आवश्यक सावधानियां बरतनी चाहिए। पूरे प्रयोग Biosafety स्तर 2 (BSL2) रोकथाम की आवश्यकता है. पशु अध्ययन में शामिल शोधकर्ता प्रयोग की अवधि के लिए डिस्पोजेबल व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण (PPE) पहनना चाहिए.
- विवो संक्रमण अध्ययन के लिए बैक्टीरिया की तैयारी
- जीसी (Gonococcal) agar प्लेट पर एक ताजा नीसेरिया मेनिंगिटिस संस्कृति से एक एकल कॉलोनी उठाओ 1% (vol/vol) Polyvitox पूरक और जीसी शोरबा के 10 एमएल में टीका के साथ पूरक।
- 220 आरपीएम की गति के साथ एक कक्षीय शेकर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर बैक्टीरिया को बढ़ाएं। एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ संस्कृति के ओ.डी. की जाँच रखें. 0.7 की एक ऑप्टिकल घनत्व OD600nm पर जल्दी घातीय चरण तक संस्कृति हो जाना, करने के लिए इसी $ 7 x 108 CFU /
- एक बार आवश्यक ओ.डी. प्राप्त किया जाता है, 10% ग्लिसरोल जोड़कर जमे हुए स्टॉक बनाते हैं। क्रायोविलमेंट्स में संस्कृति का 1 एमएल का वितरण करें। उपयोग करने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर शीशियों को स्टोर करें।
नोट: हालांकि यह ताजा जीवाणु संस्कृति का उपयोग करने के लिए बेहतर है, जमे हुए शेयरों को सरल और vivo प्रयोग में मानकीकरण के लिए इस्तेमाल किया गया. आमतौर पर जमे हुए स्टॉक तैयारी से लगभग 6 महीने के भीतर नियोजित किया गया है. - संक्रमण से पहले, कमरे के तापमान पर जमे हुए बैक्टीरिया को थपथपाएं।
- 15 000 x ग्राम पर 15 मिनट के लिए अपकेंद्रण द्वारा जीवाणु कोशिकाओं को फसल और लोहे के डेक्सट्रान युक्त ताजा जीसी शोरबा के 1 एमएल में पुन: निलंबित करें (5 मिलीग्राम/
नोट: जीसी शोरबा को मेजबान ऊतक14,18,27में मेनिंगोकोकी की प्रतिकृति के पक्ष में लोहे के डेक्सट्रान (5 मिलीग्राम/किग्रा ) के साथ तैयार किया जाता है . - का उपयोग करने से पहले, बैक्टीरिया की व्यवहार्य गिनती प्रदर्शन करने के लिए संक्रमण के लिए CFU की सही संख्या निर्धारित. ऐसा करने के लिए, बैक्टीरियल निलंबन के 10 डिग्री सेल्सियस को चुनें और सीरियल कमजोर पड़ने के साथ आगे बढ़ें और जीसी आगर प्लेटों पर प्रत्येक कमजोर पड़ने को फैलाएं और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2के साथ, 18-24 एच के लिए।
- चूहों का इंट्रा-सिस्टरल इंजेक्शन
नोट:पूरी प्रक्रिया aseptic शर्तों को बनाए रखने के लिए स्तरीय प्रवाह कैबिनेट में किया जाता है.- घर प्रयोगशाला चूहों (8 सप्ताह पुराने, महिला Balb/ भोजन छर्रों और पानी विज्ञापन libitum प्रदान करें.
- प्रयोग शुरू करने से पहले 1 सप्ताह के लिए नए वातावरण में जानवरों को व्यवस्थित करें।
- प्रयोग शुरू करने से पहले, वजन और उनके शरीर के तापमान का मूल्यांकन.
नोट: आठ सप्ताह के बच्चे की इनब्रेड बलब/सी मादा चूहों का वजन औसतन 19 ग्राम है। प्रयोगशाला चूहों का औसत तापमान शारीरिक रूप से 36-38 डिग्री सेल्सियस24से लेकर . - गर्दन से जानवर को घसीटना, 70% इथेनॉल के साथ पेट के क्षेत्र को साफ करें और आई.पी. आयरन डेक्सट्रन को इंजेक्ट करें (1 % फॉस्फेट नमकीन बफर में भंग, 250 मिलीग्राम/किलोग्राम) एक 25 जी सुई 0.5 मिमी x 16 मिमी का उपयोग करके मरिन पेट के निचले दाएँ वृत्ताकार में , लगभग 2-3 एच संक्रमण से पहले.
नोट: मूत्राशय, सीकम आदि जैसे हानिकारक पेट अंगों से बचने के लिए मूत्राशय पेट के निचले दाहिने वृत्त का चतुर्थ भाग में इंट्रापर्टोनल इंजेक्शन किया गया था। बाह्य जात लौह स्रोत का प्रशासन , लौह डेक्सट्रान के रूप में , संक्रमण से पहले जानवरों के लिए मेजबान14,18,27में जीवाणु गुणन के पक्ष में है . - 2-3 ज के बाद, केटामाइन (50 मिलीग्राम/किग्रा) और जाइलज़ीन (3 मिलीग्राम/किलोग्राम) और नेत्र स्नेहक के साथ पशु संज्ञाहरण करें।
- दर्द प्रतिक्रिया के अभाव को सुनिश्चित करने के द्वारा संज्ञाहरण की गहराई के लिए जाँच करें.
- माउस को स्टर्नल डेक्यूबिटस में रखें और कशेरुक स्तंभ को सीधे स्थिति में रखने के लिए अंगों और गर्भाशय ग्रीवा रीढ़ को सावधानी से फैलाएं।
- 30 जी सुई x 8 मिमी की सिरिंज लोड करने से पहले लगातार निलंबन बनाए रखने के लिए बैक्टीरिया निलंबन को धीरे से मिलाएं।
नोट: इंजेक्शन समय के लिए संभव के रूप में बंद के रूप में जीवाणु निलंबन तैयार; इस बीच, यह कमरे के तापमान पर स्टोर. - बैक्टीरियल टिटर (CFU/mL) के बाद के आधार पर, संक्रमित होने वाले जानवरों की कुल संख्या (जानवरों की संख्या के अनुसार CFU बैक्टीरियल खुराक) के संबंध में उपयोग किए जाने वाले कुल CFU की गणना के साथ आगे बढ़ें। शीशी से लिया जा करने के लिए सटीक मात्रा की गणना के साथ आगे बढ़ें पोस्ट thawing बैक्टीरियल टिटर (CFU/mL) और कुल CFU n चूहों के संक्रमण के लिए उपयोगी के बीच एक अनुपात लागू करने के लिए कुल CFU प्राप्त करने के लिए (पोस्ट thawing बैक्टीरियल टिटर CFU : मिलीलीटर - कुल CFU: ग). संक्रमित होने के लिए जानवरों की कुल संख्या के संबंध में अंतिम मात्रा की स्थापना.
नोट: इन प्रयोगों में, प्रति जानवर 10से 109 तक टिटर की एक विस्तृत श्रृंखला का उपयोग किया गया था। - 70% इथेनॉल के साथ सर्जिकल क्षेत्र को साफ करें।
- एक सुई की मदद से इंजेक्शन बिंदु की पहचान और meningococi की स्थापित CFU सुई (जंगली प्रकार तनाव और isogenic उत्परिवर्ती तनाव), या जीसी शोरबा लोहे डेक्सटर्न के साथ पूरक (5 mg/kg) नियंत्रण के रूप में, चूहों के cisterna मैग्ना में 10 $L की कुल मात्रा में एक 30 जी सुई x 8 मिमी का उपयोग करके एक पश्चकपाल बर्र छेद के माध्यम से।
- क्रैनियोसर्कल जंक्शन पर सुई रखकर सिस्टरनल इनोकुलम को विशेष रूप से पृष्ठीय सबरैकनॉइड अंतरिक्ष में निष्पादित करें। इस स्थान को सुलभ बनाने के लिए सिर को वेंट्रोफ्लेक्स28.
- संक्षेप में, पार्श्व recumbency में जानवर जगह है, रास्ते से बाहर कान पकड़ और गर्दन मामूली फ्लेक्स (90 से 100 डिग्री). सुनिश्चित करें कि गर्दन और सिर की मिडलाइन (नाक से occiput करने के लिए) tabletop करने के लिए पूरी तरह से समानांतर स्थिति में हैं।
- एटलस पंखों को स्पर्श करें और सुनिश्चित करें कि वे ओवरलैप करते हैं, अक्षीय रोटेशन को नष्ट करते हैं। एक प्राकृतिक इंडेंटेशन आमतौर पर मिडलाइन पर छुआ जा सकता है जहां सुई को पश्चकपाल छेद में प्रवेश करने की सबसे अधिक संभावना होती है।
- नीसेरियाके साथ चूहों के इंजेक्शन के बाद सिरिंज और सुई को सुरक्षित रूप से छोड़ दें .
- पिंजरे में जानवर प्लेस और जागृति और आंदोलन की पूरी वसूली के लिए प्रतीक्षा करें।
- संक्रमित चूहों के साथ पिंजरों को एक स्तरीय प्रवाह कैबिनेट के तहत रखें।
- मॉनिटर चूहों, 24 एच पोस्ट संक्रमण, कोमा पैमाने के अनुसार कोमा के नैदानिक लक्षण के लिए29| कोमा पैमाने: 1 $ कोमा, 2 ] पीठ पर चालू होने के बाद सीधा खड़ा नहीं होता है, 3 ] 30 s के भीतर सीधा खड़ा है, 4 ] 5 s के भीतर ईमानदार खड़ा है, कम से कम ambulatory गतिविधियों, 5 ] सामान्य.
नोट: जब जानवरों में दर्द दर्ज किया गया था, meloxicam के साथ analgesia (5 मिलीग्राम / किलो अध्ययन की अवधि के लिए आई.पी.) प्रशासित किया गया था. - पशु अस्तित्व के लिए आगे बढ़ें या CFU चरण 2 में विस्तृत के रूप में संक्रमित जानवरों पर परख मायने रखता है।
- गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा 2 के स्कोर के साथ चूहों की इच्छामृत्यु प्रदर्शन और सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए मृत के रूप में रिकॉर्ड.
2. पशु जीवन रक्षा और CFU गणना
-
पशु अस्तित्व
- आई.सी.टी. द्वारा पशुओं को संक्रमित करने के लिए विभिन्न खुराक (10से 10 से 109 CFU प्रति माउस) पर बैक्टीरियल इनोकुला तैयार करें। मार्ग (चरण 1.2) देखें.
- जीसी शोरबा के साथ नियंत्रण चूहों टीका, लोहे डेक्सट्रन के साथ पूरक (5 मिलीग्राम /
- नैदानिक लक्षणों के लिए जानवरों की निगरानी करें: झालरदार फर, hunched उपस्थिति, हाइपोथर्मिया, वजन घटाने, सुस्ती, या मरणासन्न24,25,26,30, 168 ज के लिए पूरे प्रयोग भर में हर दिन (7 दिन) प्रयोग की अवधि के लिए कम से कम दो बार दिन.
- एक डिजिटल संतुलन और एक गुदा थर्मामीटर का उपयोग करके शरीर के वजन और तापमान को मापने, क्रमशः हर रोज.
- एक सप्ताह के लिए चूहों के अस्तित्व को रिकॉर्ड करें।
नोट: पशु पोस्ट संक्रमण की प्राकृतिक मौत रिकॉर्ड है, जबकि जानवरों है कि 2 के एक कोमा मूल्य तक पहुँचने या कि अवलोकन के 168 एच से अधिक जीवित euthanized किया जाएगा. - केटामाइन (50 मिलीग्राम/किग्रा) और जाइलज़ीन (3 मिलीग्राम/किग्रा) के साथ अवलोकन समय पर जीवित रहने वाले 2 या उस कोमा मूल्य वाले चूहों को एनेस्थेटाइज करें और नेत्र मलम लागू करें।
- जाँच करें कि दर्द की प्रतिक्रिया को हाथ से चुटकी से अनुपस्थित है.
- गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा चूहों की इच्छामृत्यु प्रदर्शन और सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए मृत के रूप में रिकॉर्ड.
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कॉलोनी बनाने इकाइयों का मूल्यांकन (CFU) परिधीय अंगों में गिना जाता है
- पशु अस्तित्व के परिणामों के आधार पर एक उप घातक जीवाणु खुराक (5 x 105CFU/mice) का उपयोग करें i.cist द्वारा पशुओं को टीका लगाने के लिए। मार्ग (उपधारा 1.2) देखें.)
- संक्रमण के दौरान हर दिन गुदा तापमान की निगरानी करें और चरण 2 में उल्लिखित 48 एच पोस्ट संक्रमण पर जानवरों की संज्ञाहरण करें।
- छाती के 70% इथेनॉल कीटाणुशोधन के साथ आगे बढ़ें और 25 जी सुई 0.5 मिमी x 16 मिमी का उपयोग करके छाती गुहा के हृदय पंचर द्वारा 600-700 डिग्री सेल्सियस रक्त वापस ले लें।
- बाद में व्यवहार्य जीवाणु कोशिका गिनती के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर 3.8% सोडियम साइट्रेट युक्त ट्यूब में रक्त ले लीजिए और स्टोर।
- जानवरों की बलि देने के लिए गर्भाशय ग्रीवा की अव्यवस्था करें। सभी प्रासंगिक संस्थागत और नैतिक दिशा निर्देशों के अनुसार माउस का त्याग करने के बाद, दिल की धड़कन के अभाव की रिकॉर्डिंग मौत की पुष्टि करें।
- सुपाच्य स्थिति में माउस रखना और कैंची और बलकेड़ का उपयोग करने के लिए शरीर के sagittal विमान के साथ फर की कटौती के साथ आगे बढ़ना. पिन के साथ शरीर के पक्षों पर फर के साथ त्वचा को ठीक करें।
- तेज कैंची का उपयोग करके पर्णामूलक झिल्ली को काट दें। अंगों (उदा., तिल्ली और जिगर) उत्पाद ित करने के लिए कैंची और डिस्पोजेबल संदंश का उपयोग करें और जीसी शोरबा के 1 एमएल के साथ बाँझ पेट्री डिश में हर एक को 10% (वॉल/
- IACIC दिशानिर्देशों के अनुसार माउस निकाय को सुरक्षित रूप से निपटान करें।
- एक एकल सेल निलंबन का गठन किया है जब तक के बारे में 2-3 मिनट के लिए एक 5 एमएल सिरिंज के प्लंजर के साथ कमरे के तापमान पर यांत्रिक रूप से अंगों homogenize और यह एक ट्यूब में स्थानांतरित.
- ट्यूब को समुदेय ऊतक के नमूने के साथ तुरंत सूखी बर्फ पर रख दें।
नोट: नमूने बाद में अंक पर व्यवहार्य जीवाणु सेल गिनती मूल्यांकन प्रदर्शन के लिए एक 2 एमएल बाँझ ट्यूब में -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। - जब आवश्यक एंटीबायोटिक दवाओं के साथ जीसी agar प्लेटें बनाओ. 2-3 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व इनक्यूबेटिंग के उपयोग से पहले प्लेटों को सुखाएं।
- जीसी गर प्लेटों पर प्रत्येक homogenized ऊतक और प्लेट से जीसी शोरबा में नमूनों की 10 गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने तैयार करें। 5% सीओ2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रात में इनक्यूबेट करें।
3. CFU गणना के लिए मस्तिष्क ऊतकों की तैयारी
- पशु अस्तित्व के परिणामों के आधार पर एक उप घातक जीवाणु खुराक (5 x 105 CFU/mice) का उपयोग करें i.cist द्वारा पशुओं को टीका लगाने के लिए। मार्ग (उपधारा 1.2) देखें.)
- चरण 2 में वर्णित के रूप में स्थापित संक्रमण समय पर जानवरों की संज्ञाहरण प्रदर्शन करते हैं।
- गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा जानवरों की इच्छामृत्यु प्रदर्शन करते हैं।
- 70% इथेनॉल के साथ सर्जिकल क्षेत्र को साफ करें।
- एक बड़ी कैंची का उपयोग कर माउस के सिर काट.
- छोटे शल्य कैंची और एक ठीक टिप स्टील बलप्स की मदद से फर और त्वचा को फिर से काटना, खोपड़ी के शीर्ष की ओर आगे बढ़ने के लिए स्पष्ट रूप से टांके देखने के लिए और कपाल के उद्घाटन मार्गदर्शन करने में सक्षम हो.
- खोपड़ी खोलने के लिए रंमन मैग्नम के माध्यम से एक छोटे कैंची की नोक डालें।
- कपाल के केंद्र की ओर और खोपड़ी के विपरीत पक्ष के लिए पार्श्विक हड्डी की मध्य रेखा के पार कट. लैंडोइड सीवन के पार्श्व रिम के साथ धीरे से काट दिया।
- पीछे की ओर पैरीटल कोने से शुरू कपाल लिफ्ट और ठीक टिप ्ड संदंश का उपयोग करके, मस्तिष्क की खोज करने के लिए तिरछे ऊपर की ओर खींच।
- सुनिश्चित करें कि मस्तिष्क ऊतक सिर की किसी भी हड्डी से जुड़ा नहीं है, जब खोपड़ी उठाया जाता है.
- खोपड़ी और मस्तिष्क के बीच किसी भी संयोजी ऊतक को हटाने के लिए डिस्पोजेबल संदंश का उपयोग करें, यह सुनिश्चित करने के लिए कि मस्तिष्क के ऊतकों को खोपड़ी के साथ हटाया जा रहा है।
- मस्तिष्क के ऊतकों को बहुत अधिक सूखने की अनुमति न दें। मस्तिष्क प्लेस, डिस्पोजेबल संदग का उपयोग कर, जीसी शोरबा के 1 एमएल के साथ एक पेट्री डिश में 10% के साथ पूरक (vol/
- 5 एमएल सिरिंज के प्लंजर के साथ मस्तिष्क को यंत्रवत् रूप से Homogenize (चरण 2.2.9 देखें)। एक 2 एमएल बाँझ ट्यूब में नमूनों स्थानांतरण और बाद में व्यवहार्य जीवाणु कोशिका गिनती मूल्यांकन के लिए -80 डिग्री सेल्सियस की दुकान के रूप में चरण 2.2 में चर्चा की.
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Representative Results
एन मेनिंगटिडिस जंगली प्रकार और आइसोजेनिक उत्परिवर्ती उपभेदों से संक्रमित चूहों की उत्तरजीविता।
इन प्रतिनिधि परिणामों में प्रयुक्त नेसेरिया मेनिंगिटिस उपभेदों सीरोग्रुप सी संदर्भ तनाव 93/4286 (ET-37) और इसके isogenic उत्परिवर्ती 93/4286csSA सीएसएसए जीन की सम्मिलनात्मक निष्क्रियता द्वारा प्राप्त कर रहे हैं, के लिए कोडिंग यूडीपी-एन-ऐसीटिलग्लूकोसामाइन 2-एपिमैरेज, कि कैप्सूल संश्लेषण टिड्डी25में नक्शे । वर्तमान murine मॉडल में cssAदोषपूर्ण तनाव की उग्रता की डिग्री का आकलन करने के लिए, घातक खुराक संक्रमित जानवरों के 50% की मौत का निर्धारण करने में सक्षम (एलडी50) का मूल्यांकन किया गया था। इस उद्देश्य के लिए जानवरों के तीन समूहों को 10से लेकर खुराक के साथ intracisternly संक्रमित थे 4 106 CFU जंगली प्रकार तनाव के 93/4286 और उत्परिवर्ती तनाव की खुराक के साथ 93/4286cssA के बीच 107 करने के लिए 109 CFU . आम तौर पर, नैदानिक मापदंडों की कमी (जैसे, शरीर के वजन और तापमान) और मृत्यु दर में वृद्धि संक्रमण के बाद पहले 72 घंटे के भीतर हुआ। जंगली प्रकार के तनाव के लिए एलडी50 104 CFU के मेनिंगोकोकल चुनौती के अनुरूप है, जबकि 105 CFU की खुराक के साथ मृत्यु दर 83.4% के बराबर थी और 106 CFU के साथ 100% (चित्र 1A)। इसके विपरीत, उत्परिवर्ती तनाव के लिए एलडी50 प्राप्त करने के लिए 93/4286csSA, यह आवश्यक हो गया है की एक खुराक 108 CFU (चित्र 1B),10,000 गुना की एक राशि जंगली प्रकार तनाव की तुलना में उच्च.
माउस मस्तिष्क के ऊतकों में एन मेनिंगटिडिस व्यवहार्य CFU का मूल्यांकन.
संक्रमित जानवरों के मस्तिष्क के ऊतकों में संक्रमण की गतिजता का पालन करने के लिए, एक समय पाठ्यक्रम परख जंगली प्रकार या cssA उत्परिवर्ती तनाव25के साथ किया गया था. आई.सी.सी. के बाद। 5x105 CFU के साथ इंजेक्शन 93/4286 या 93/4286]csA उपभेदों, वहाँ मस्तिष्क के ऊतकों में जंगली प्रकार के बैक्टीरिया की एक तेजी से वृद्धि हुई थी लगभग 24 एच पोस्ट संक्रमण पर उच्चतम संख्या तक पहुँचने (चित्र 2A); इसके विपरीत isogenic cssAके साथ चुनौती दी चूहों के मस्तिष्क में दोषपूर्ण उत्परिवर्ती, व्यवहार्य मायने रखता है समय के साथ उत्तरोत्तर गिरा दिया जब तक 2.026 लॉग CFU ] 1.774 72 एच पोस्ट संक्रमण (चित्र 2A). प्रयोग से पता चला है कि उत्परिवर्ती चुनौती दी चूहों के 33.3% संक्रमण साइट से जीवाणु निकासी दिखाया, जबकि जंगली प्रकार के तनाव के साथ संक्रमण जानवरों के मस्तिष्क से उन्मूलन कभी नहीं किया गया था.
प्लीहा और लिवर 48h पोस्ट-चैलेंज में मेनिंगोकोकल लोड का मूल्यांकन।
यह प्रयोग परिधीय अंगों में संक्रमित चूहों 48 एच पोस्ट-चैलेंज से बैक्टीरिया की निकासी का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था। इस उद्देश्य के लिए, चूहों के दो समूहों से संक्रमित थे 5 x 105 CFU या तो 93/4286 या 93/4286]csA उपभेदों, और जीवाणु व्यवहार्य मायने रखता है तिल्ली और संक्रमित चूहों के जिगर में मूल्यांकन किया गया25 (चित्र 2B). मेनिंगोकोकल इंजेक्शन से 48 एच के बाद, सीएसए- दोषपूर्ण उत्परिवर्ती को तिल्ली और यकृत में पूरी तरह से मंजूरी दे दी गई थी, जबकि जंगली प्रकार के तनाव से संक्रमित जानवरों ने लगातार प्रणालीगत संक्रमण ढांचे का प्रदर्शन किया। CFU के बाद मतलब मूल्यों 48 एच वास्तव में अभी भी थे 3.212 लॉग CFU - 3.354 और 6.949 लॉग CFU - 1.37 तिल्ली और जिगर में, क्रमशः. दो पशु समूहों के जिगर के ऊतकों में जीवाणु भार में अंतर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण था (एक पी और lt के साथ; 0.001).
चित्र 1: 93/4286 जंगली प्रकार या cssA-दोषपूर्ण एन मेनिंगिटाडिस उपभेदों से संक्रमित चूहों की उत्तरजीविता। (क)बलब/ग चूहों के तीन समूह (द] 6/ के साथ 104, 105, और 106 CFU / जंगलीप्रकार तनावके CFU/ चूहे एक सप्ताह के लिए निगरानी की गई, और अस्तित्व दर्ज किया गया था. परिणाम समय के साथ अलग खुराक पर प्रतिशत अस्तित्व के रूप में व्यक्त कर रहे हैं, लॉग रैंक च मान था और 0.05 जंगली प्रकार तनाव से संक्रमित चूहों के लिए. यह आंकड़ा Colchio एट अल25से संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: चूहों में समय के साथ जीवाणु भार का मूल्यांकन 93/4286 या 93 डिग्री 4286 के साथ inoculatedcssA उपभेदों. (क)मस्तिष्क के ऊतकों में जीवाणु भार का समय पाठ्यक्रम i.cist के बाद. संक्रमण. बालब/ग चूहों (द र् 20/समूह) के दो समूह i.cist द्वारा संक्रमित थे। 5 x 105 CFU के साथ मार्ग या तो जंगली प्रकार तनाव 93/4286 या CSSA-दोषपूर्ण उत्परिवर्ती. संक्रमण के बाद जानवरों को 4, 24, 48 और 72 एच बलिदान दिया गया। दिमाग काटा गया, यंत्रवत् GC माध्यम में homogenized, और व्यवहार्य मायने रखता निर्धारित किया गया. परिणाम टीका के बाद अलग अलग समय बिंदुओं पर प्रति अंग CFU संख्या के एसडी लॉग के माध्यम से व्यक्त कर रहे हैं. Asterisks सांख्यिकीय महत्व (*, पी और lt; 0.01) इंगित करते हैं। (बी) जीवाणु तिल्ली और यकृत में समय के साथ भार. बलब/ग चूहों (द र् 5/समूह) के दो समूह संक्रमित थे। के साथ 5 x 105 या तो जंगली प्रकार तनाव के CFU 93/4286 या CSSA-दोषपूर्ण उत्परिवर्ती. संक्रमण के बाद पशुओं को 48 एच इच्छामृत्यु दी गई। तिल्ली और जिगर काटा गया, यंत्रवत् homogenized, और व्यवहार्य मायने रखता निर्धारित किया गया. परिणाम अंग प्रति लॉग CFU संख्या के रूप में व्यक्त कर रहे हैं. क्षैतिज सलाखों जीवाणु titers के मतलब लॉग से संकेत मिलता है. Asterisks सांख्यिकीय महत्व (* *, पी और 0.001) से संकेत मिलता है। यह आंकड़ा Colchio एट अल25से संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
इस अध्ययन में, हम i.cist द्वारा वयस्क चूहों में मेनिंगोकोकल मेनिनजाइटिस प्रेरित करने के लिए एक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। मेनिंगोकोकल बैक्टीरिया का टीका. हमारी जानकारी के अनुसार, आई.सी.सी. द्वारा संक्रमित प्रयोगशाला चूहों में मेनिंगोकोकल मैनिमेंटाइटिस का कोई अन्य मॉडल विकसित नहीं किया गया है। मार्ग; अतीत में, इस तरह से दोनों चूहे31 और खरगोश32में मेनिंगोकोकल मैनिमेंटाइटिस के मॉडल प्रदान करने के लिए पता लगाया गया है। यह सुविदित है कि मेनिंगोकोकल रोग की उच्चतम दर छोटे बच्चों, किशोरों और युवा वयस्कों के बीच पाई जाती है33,34,35; इस कारण से, हमारे मैनिमेंडिंकाइटिस माउस मॉडल में, नवजात या शिशु जानवरों पर ध्यान केंद्रित करने के बजाय, 8 सप्ताह पुराने इम्यूनोसक्षम जानवरों को नियोजित किया गया था।
हमारे प्रयोगात्मक मॉडल में, हम i.cist का उपयोग करने का फैसला किया. inoculum के रूप में यह सीधे cisterna मैग्ना में meningococi की रिहाई सुनिश्चित करता है ताकि सीएसएफ में जीवाणु प्रतिकृति की सुविधा. टीका लगाने का यह मार्ग शारीरिक रूप से अधिक सुलभ है28 और इंट्राक्रैनियल सबरैकनॉइडी मार्ग की तुलना में कम दर्दनाक, पहले से ही स्ट्रेप्टोकॉकस एसपी के कारण मैनिजनाइटिस के विकास के लिए इस्तेमाल किया जाता है। 36,37. हालांकि यह मेनिंगोकोकस के संक्रमण के प्राकृतिक तरीके का प्रतिनिधित्व नहीं करता है, इस क्षेत्र में बैक्टीरिया का इंजेक्शन मेनिंगोकोकल मेनिनजाइटिस को शामिल करने के लिए महत्वपूर्ण था, जैसा कि माउस अस्तित्व, बैक्टीरिया लोड, नैदानिक मापदंडों द्वारा दिखाया गया है, और भी हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण24,25,26. दिलचस्प बात यह है कि संदर्भ विकृति 93/4286 प्रेरित मैनिजिसाइटिस के साथ हिस्टोपैथोलॉजिकल विशेषताओं मानव रोग में मनाया उन नकल24,25,26.
एक मानकीकृत murine संक्रमण स्थापित करने के लिए और शोधकर्ताओं की सुरक्षा की गारंटी के लिए, यह एक ताजा जीवाणु विकास24,25,30के बजाय बैक्टीरिया की एक titrated जमे हुए स्टॉक से शुरू करने के लिए पसंद किया गया था, इसकेअतिरिक्त , हमने तीव्र घातक परिणाम को सीमित करने और मस्तिष्कक्षति2, 24,25,26के विकास की अनुमति देने के उद्देश्य से जीवित मेनिंगोकोकी की उप-घातक खुराक का उपयोग करने का निर्णय लिया . फिर भी, विभिन्न उपभेदों के लिए एक उपयुक्त संक्रामक खुराक निर्धारित करने के लिए, प्रारंभिक प्रयोगों प्रदर्शन किया जाना चाहिए. वर्तमान अध्ययन में, हम एक सीरोग्रुप सी संदर्भ तनाव 93/4286 और एक isogenic उत्परिवर्ती तनाव 93/4286 की एक खुराक के साथcssA परीक्षण किया 5 x 105 CFU /
हालांकि इस मॉडल उपनिवेश और मेनिंगोकोकस के आक्रमण के प्रारंभिक चरणों की नकल नहीं करता है, जीवाणु अलग न केवल सीएसएफ में अच्छी तरह से बढ़ता है, लेकिन यह तिल्ली और जिगर के डिब्बों में रहने में भी सक्षम है। नेसेरेसीरियल संक्रमण के हाइपोफेरेमिक चरण के दौरान, हेम व्युत्पन्न लोहे के अधिकांश जिगर फेरिटिन के साथ संयुक्त रहता है। के रूप में फेरिटिन लौह प्राप्त करने के लिए meningococi इस्तेमाल किया जा सकताहै 39, जिगर जीवाणु प्रतिकृति के लिए एक लक्ष्य अंग का गठन.
इस प्रयोगात्मक प्रक्रिया में, इनब्रेड बलब/सी माउस स्ट्रेन का उपयोग आउटब्रेड सीडी-1 स्ट्रेन के स्थान पर किया गया था जो मूल रूप से मेनिंगोकोकल मेनिनजाइटिस मॉडल24को विकसित करने के लिए नियोजित किया गया था। बहिरंग चूहों की विशेषता व्यापक आनुवंशिक परिवर्तनशीलता थी जो मानव जनसंख्या40,41जैसे परिवर्तनीय सहगण में अनेक प्रभावों को प्रकट करने के लिए अधिक उपयुक्त हो सकती है . हालांकि, इस परिवर्तनशीलता पर्याप्त सांख्यिकीय महत्व प्राप्त करने के लिए एक उच्च नमूना आकार की जरूरत है और प्रक्रियाओं और लक्षित अध्ययन के मानकीकरण के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं.
मेनिंगोकोकस की संकीर्ण मेजबान रेंज के बावजूद, मौरीन होस्ट में बैक्टीरिया की प्रतिकृति सुनिश्चित करने और मेनिंगोकोची की उग्रता को बढ़ाने के लिए, संक्रमण6,14से पहले जानवरों को लोहे की डेक्सट्रन प्रशासित किया गया था। अंत में, मैनिमेंटिस के अन्य प्रयोगात्मक मॉडल की तुलना में, जानवरों को किसी भी एंटीबायोटिक दवाओंके साथ इलाज नहीं किया गया, रोग के पाठ्यक्रम को प्रभावित नहीं करने के लिए और /
तारीख करने के लिए, हमारे अध्ययन पर प्रकाश डाला है कि i.cist. मॉडल आई.पी. या आई.एन. संक्रमण के मॉडल की तुलना में मैनिंकोकल रोग दोनों को प्रेरित करने के लिए कार्यात्मक है, जो मेनिनजाइटिस की स्थापना से पहले सेप्सिस और जीवाणुमिया की घटना की विशेषता है10,11 ,12,13,14,15,16,17. इसलिए, यह संक्रमण मॉडल murine मेजबान में मैनिंजाइटिस के प्रेरण पर आधारित है, न केवल सीएसएफ में सीधे जीवाणु प्रतिकृति को रोकने के लिए अभिनव चिकित्सीय रणनीति का मूल्यांकन करने के लिए उपयोगी हो सकता है, लेकिन यह भी संभव निष्क्रिय प्रतिरक्षा की प्रभावकारिता का विश्लेषण करने के लिए मानव रोगजनकों के खिलाफ चिकित्सा।
हालांकि मेनिंगोकोकल संक्रमण एक multistep प्रक्रिया है, कि nasopharynx उपनिवेशन भी शामिल है, खून के लिए उपयोग, रक्त मस्तिष्क बाधा को पार करने और अंत में सीएसएफ में अनियंत्रित प्रसार, हमारे मॉडल केवल कुछ पहलुओं को पुन: पेश करता है मेनिंगोकोकल संक्रमण, भाग में इन सीमाओं ट्रांसजेनिक पशु मॉडल को नष्ट करने के लिए मेनिंगोकोकल रोग के मानव रोगजनन की नकल करने के लिए उपयोगी हो सकता है।
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Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
अध्ययन PRIN द्वारा भाग में समर्थित थे 2012 [अनुदान संख्या 2012WJSX8K]: "होस्ट-माइक्रोब बातचीत मॉडल mucosal संक्रमण में: उपन्यास चिकित्सीय रणनीतियों का विकास" और PRIN द्वारा 2017 [2017SFBFER]: "एक एकीकृत दृष्टिकोण के बीच परस्पर क्रिया से निपटने के लिए अनुकूलन, तनावपूर्ण स्थितियों और चुनौतीपूर्ण रोगजनकों के एंटीमाइक्रोबियल प्रतिरोध"।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,8 Skirted Cryovial With external thread | Starlab | E3090-6222 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352070 | 30 mm x 115 mm |
| Adson Forceps | F.S.T. | 11006-12 | Stainless Steel |
| Alarm-Thermometer | TESTO | 9000530 | |
| BactoTM Proteose Peptone | BD | 211693 | |
| BD Micro Fine syringe | BD | 320837 | U-100 Insulin |
| BD Plastipak syringe 1 mL 25 G 5/8 inch | BD | 300014 | 05 mm x 16 mm |
| BD Plastipak syringe 5 mL | BD | 308062 | 07 mm x 30 mm |
| BIOHAZARD AURA B VERTICAL LAMINAR FLOW CABINET | Bio Air s.c.r.l. | Aura B3 | |
| BioPhotometer | Eppendorf | Model #6131 | |
| Bottle D | Tecniplast | D | Graduated up to: 400 mL, Total Volume 450 mL, 72 mm x 72 mm x 122 mm |
| C150 CO2 Incubator | Binder | 9040-0078 | |
| Cage Body Eurostandard Type II | Tecniplast | 1264C | 267 x 207 x 140 mm3, Floor area 370 cm2 |
| Cell Culture Petri Dish With Lid | Thermo Scientific | 150288 | Working Volume: 5 mL |
| Centrifuge | Eppendorf | Microcentrifuge 5415R | |
| Cuvetta semi-micro L. Form | Kartell S.p.A. | 01938-00 | |
| di-Potassium hydrogen phosphate trihydrate | Carlo erba | 471767 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate anhydrous ACS-for analysis | Carlo Erba | 480141 | g1000 |
| Diete Standard Certificate | Mucedola s.r.l. | 4RF21 | Food pellet for animal |
| Dumont Hp Tweezers 5 Stainless Steel | F.S.T. by DUMONT | AGT5034 | 0.10 x 0.06 mm2 tip |
| Electronic Balance | Gibertini | EU-C1200 | Max 1200 g, d = 0.01 g, T = -1200 g |
| Eppendorf Microcentrifuge tube safe-lock | Eppendorf | T3545-1000EA | |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich | E-6376 | 25 g |
| Extra Fine Bonn Scissors | F.S.T. | 14084-08 | Stainless Steel |
| Filter Top (mini- Isolator), H-Temp with lock clamps | Tecniplast | 1264C400SUC | |
| GC agar base | OXOID | CM0367 | |
| Gillies Forceps 1 x2 teeth | F.S.T. | 11028-15 | Stainless Steel |
| Glicerin RPE | Carlo Erba | 453752 | 1 L |
| Graefe Forceps | F.S.T. | 11052-10 | Serrated Tip Width: 0.8 mm |
| Inner lid | Tecniplast | 1264C116 | |
| Iron dextran solution | Sigma-Aldrich | D8517-25ML | |
| Ketamine | Intervet | ||
| Microbiological Safety Cabinet BH-EN and BHG Class II | Faster | BH-EN 2004 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | BRAND | PP780751 | screw cap PP, grad |
| Mouse Handling Forceps | F.S.T. | 11035-20 | Serrated rubber; Gripping surface: 15 mm x 20 mm |
| Mucotit-F2000 | MERZ | 61846 | 2000 mL |
| Natural Latex Gloves | Medica | M101 | |
| New Brunswick Classic C24 Incubator Shaker | PBI international | C-24 Classic Benchtop Incubator Shaker | |
| Petri PS Dishes | VWR | 391-0453 | 90 x 14.2 mm2 |
| Pipetman Classic P20 | Gilson | F123600 | 2-20 μL |
| Pipetman Classic P200 | Gilson | F123601 | 20-200 μLL |
| Pipetman Classim P1000 | Gilson | F123602 | 200-1,000 μL |
| Polyvitox | OXOID | SR0090A | |
| Potassium Chloride | J.T. Baker Chemicals B.V. | 0208 | 250 g |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | J.T. Baker Chemicals B.V. | 0240 | 1 kg |
| PS Disposible forceps | VWR | 232-0191 | |
| Removable Divider | Tecniplast | 1264C812 | |
| Round-Bottom Polypropylene Tubes | Falcon | 352063 | 5 mL |
| Sodium Chloride | MOLEKULA | 41272436 | |
| SS retainer and Polyester FilterSheet | Tecniplast | 1264C | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T. | 11000-12 | Stainless |
| Stevens Tenotomy Scissors | F.S.T. | 14066-11 | Stainless Steel |
| Surgical Scissor - ToughCut | F.S.T. | 14130-17 | Stainless |
| Touch N Tuff disposible nitrile gloves | Ansell | 92-500 | |
| Ultra Low Temperature (ULT) Freezer | Haier | DW-86L288 | Volume = 288 L |
| Wagner Scissors | F.S.T. | 14070-12 | Stainless Steel |
| Xylazine | Intervet |
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