通过抗原肽和Fc-III三氧化二甲物的双功能结合阻断靶向抗体
Summary
开发抗原肽和Fc-III仿生（DCAF）的双功能结合物，是消除有害抗体的新颖方法。在这里，我们描述了DCAF1分子合成的详细方案，它可以选择性地阻断4G2抗体，以消除登革热病毒感染期间的抗体依赖增强作用。
Abstract
消除生物体的有害抗体是干预与抗体相关的疾病（如登革热出血热和自身免疫性疾病）的宝贵方法。由于数千种不同表位的抗体在血液中循环，除了抗原肽和Fc-III二酰皮（DCAF）的双重功能结合外，没有通用方法被报告针对特定的有害抗体。DCAF分子的发展对靶向治疗的进展做出了重大贡献，这证明它消除了登革热病毒（DENV）感染模型中的抗体依赖增强（ADE）效应，并促进了乙酰胆碱肌无力性模型中的受体活性。在这里，我们描述了DCAF分子（DCAF1）的合成方案，该方案可以选择性地阻断4G2抗体，以在登革热病毒感染期间减弱ADE效应，并通过ELISA测定说明DCAF1与4G2抗体的结合。在我们的方法中，DCAF1通过Fc-III肽的氢化物衍生物和通过原生化学结扎（NCL）与抗原序列表达的长螺旋的重组剂结合合成。该协议已成功应用于DCAF1以及其他DCAF分子，以靶向其共生抗体。
Introduction
抗体在体液免疫反应中起着重要作用，对致病菌和病毒的中和作用。然而，一些抗体表现出对生物体的有害影响，如在DENV感染期间ADE效应的交叉反应抗体和肌无力性代谢中的过度反应抗体，这是一种自身免疫性疾病2，3。ADE效应由交叉反应抗体介导，使连接DENV和Fc受体的桥梁呈现细胞4，5，而肌无力性是由攻击乙酰胆碱受体的过度抗体引起的在肌肉组织6，7的细胞-细胞结之间。虽然已经开发出部分有效的方法来治疗这些疾病8，9，毫无疑问，直接消除这些有害的抗体将取得进展的干预措施。
最近，DCAF分子，具有双功能组，已经开发出靶向抗体阻断10。DCAF 是一种长肽，由 3 部分组成：1） 一个抗原部分，可以具体识别共体抗体，2） Fc-III 或 Fc-III-4C 标记强结合到抗体的 Fc 区域，以抑制 Fc 受体或补充组分蛋白， 3） 一个长 _-螺旋链接器，结合这两个功能组10。从Moesin FERM域设计的链接器部分，由Rosseta软件进行优化，以确保DCAF分子中的抗原部分和Fc-III部分可以同时与IgG的Fab和Fc区域结合。合成了4种DCAF分子，靶向4种不同的抗体，其中DCAF1用于消除4G2抗体，这是DENV感染期间的交叉反应抗体，有助于ADE效应;和DACF4被设计用于拯救乙酰胆碱受体通过阻止mab35抗体在肌无力性10。
在本研究中，以DCAF1为例，我们展示了DCAF分子的合成和DCAF与其共生抗体相互作用的检测方案。DCAF1由NCL方法11、12、13、14半合成，将Fc-III肽的氢化物衍生物和表达的联结剂-抗原部分结合在一起。NCL 方法在 DCAF1 合成中具有与完全化学合成和完全重组表达的显著优势，因为这两种方法都会导致低产量和高成本。目前的方法不仅是获得全长DCAF的最经济有效的方法，而且还可以保持链接器部件的构象，类似于其原生形式。由于不同的DCAF分子除了抗原部分具有相似的序列，我们的DCAF1合成方法和DCAF1和4G2抗体之间的相互作用测定也可以应用于其他DCAF分子，以靶向块状阻滞其共性抗体。
Protocol
Representative Results
Discussion
此处的协议描述了使用 NCL 方法对 DCAF1 的半合成和检测，如图1所示。简单地说，DCAF1的两个片段分别进行了化学合成和重组表达;然后，对全长DCAF1分子进行组装、改性、纯化。对于氢化物衍生的Fc-III片段合成，使用低容量2-Cl树脂非常重要，因为高容量对氢化物的生成有负面影响，并导致产品产量低。链接器和抗原部分用SUMO标记表示有两个原因：第一，SUMO标记可以增强融合?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作部分得到了清华大学-盖茨基金会的支持（没有。OPP1021992），国家自然科学基金（第21502103号、21877068号、041301475号）和《国家重点研究发展计划》（No 2017YFA0505103）。
Materials
| 2-Chlorotrityl resin | Tianjin Nankai HECHENG S&T | ||
| 1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridinium hexafluorophosphate 3-oxide | GL Biochem | 00703 | |
| 2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminiumhexafluorophosphate | GL Biochem | 00706 | |
| 2,2′-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride | J&K Scientific | 503236 | |
| 4G2 antibody | Thermo | MA5-24387 | |
| 4-mercaptophenylacetic acid | Alfa Aesar | H27658 | |
| 96-well microtiter plates | NEST | 701001 | |
| Acetonitrile | Thermo-Fisher | A955 | MS Grade |
| AgOAc | Sinopharm Chemical Reagent | 30164324 | |
| anti-GST antibody | Abclonal | AE001 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076P2 | |
| BSA | Beijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL | ||
| CD spectrometer | Applied Photophysics Ltd | ||
| dialysis bag | Sbjbio | SBJ132636 | |
| Dichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent | 80047360 | |
| diethyl ether | Sinopharm Chemical Reagent | 10009318 | |
| DNA Gel Extraction Kit | Beyotime | D0056 | |
| Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo | ||
| GSH Sepharose | GE Lifesciences | ||
| Guanidine hydrochloride | Sinopharm Chemical Reagent | 30095516 | |
| Hydrazine hydrate | Sinopharm Chemical Reagent | 80070418 | |
| Hydrochloric acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10011018 | |
| imidazole | SIGMA | 12399-100G | |
| Isopropyl β-D-Thiogalactoside | SIGMA | 5502-5G | |
| kanamycin | Beyotime | ST101 | |
| Methanol | Thermo-Fisher | A456 | MS Grade |
| N, N-Diisopropylethylamine | GL Biochem | 90600 | |
| N, N-Dimethylformamide | Sinopharm Chemical Reagent | 8100771933 | |
| NcoI | Thermo | ER0571 | |
| PBS buffer | Solarbio | P1022 | |
| Peptide BEH C18 Column | Waters | 186003625 | |
| piperidine | Sinopharm Chemical Reagent | 80104216 | |
| Plasmid Extraction Kit | Sangon Biotech | B611253-0002 | |
| QIAexpress Kit | QIAGEN | 32149 | |
| Rapid DNA Ligation Kit | Beyotime | D7002 | |
| Sodium dihydrogen phosphate dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent | 20040718 | |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent | 10019762 | |
| Sodium nitrite | Sinopharm Chemical Reagent | 10020018 | |
| sodium chloride | Sinopharm Chemical Reagent | 10019318 | |
| Standard Fmoc-protected amino acids | GL Biochem | ||
| sterilizing pot | Tomy | SX-700 | |
| SUMO Protease | Thermo Fisher | 12588018 | |
| stop solution | Biolegend | 423001 | |
| the whole gene sequence that can express SUMO-linker-antigen | Taihe Biotechnology Compay | ||
| TMB reagent | Biolegend | 421101 | |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA | T6508 | |
| Triisopropylsilane | GL Biochem | 91100 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Aladdin | T107252-5g | |
| tryptone | OXOID | LP0042 | |
| Tween 20 | Solarbio | T8220 | |
| Ultimate 3000 HPLC | Thermo | ||
| vacuum pump | YUHUA | SHZ-95B | |
| XhoI | Thermo | IVGN0086 | |
| yeast extract | OXOID | LP0021 |
Riferimenti
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