Bloqueio de anticorpos direcionados por um conjugado duplo-funcional de peptídeo antigênico e mimetismo FC-III (DCAF)
Summary
O desenvolvimento de um conjugado dual-functional do peptide antigénico e do mimetics FC-III (DCAF) é novo para a eliminação de anticorpos prejudiciais. Aqui, nós descrevemos um protocolo detalhado para a síntese da molécula DCAF1, que pode seletivamente obstruir o anticorpo 4G2 para eliminar o efeito dependente do realce do anticorpo durante a infecção do vírus de dengue.
Abstract
A eliminação de anticorpos nocivos dos organismos é uma abordagem valiosa para a intervenção de doenças associadas a anticorpos, como a febre hemorrágica da dengue e doenças auto-imunes. Desde que os milhares de anticorpos com epítopos diferentes circulam no sangue, nenhum método universal, à exceção do conjugado duplo-funcional do peptide antigénico e dos mimetics FC-III (DCAF), foi relatado para alvejar anticorpos prejudiciais específicos. O desenvolvimento de moléculas de DCAF contribui significativamente para o avanço da terapia direcionada, que foram demonstrados para eliminar o efeito do realce dependente de anticorpos (ADE) em um modelo de infecção pelo vírus da dengue (DENV) e para impulsionar a acetilcolina atividade do receptor em um modelo do gravis da miastenia. Aqui, nós descrevemos um protocolo para a síntese de uma molécula de DCAF (DCAF1), que possa seletivamente obstruir o anticorpo 4G2 para atenuar o efeito do ADE durante a infecção do vírus de dengue, e ilustrar a ligação de DCAF1 ao anticorpo 4G2 por um ensaio de ELISA. Em nosso método, DCAF1 é sintetizado pela conjugação de um derivado de hidrazina de um peptídeo FC-III e uma α-hélice longa expressa recombinante com seqüência antigênica através de ligadura química nativa (NCL). Este protocolo foi aplicado com sucesso a DCAF1 assim como outras moléculas de DCAF para alvejar seus anticorpos cognato.
Introduction
Os anticorpos desempenham papéis importantes na resposta imune humoral para a neutralização de bactérias patogênicas e vírus1. No entanto, alguns anticorpos exibem impactos nocivos para os organismos, tais como anticorpos Cross-Reactive no efeito Ade durante a infecção por DENV e anticorpos over-reativa em miastenia gravis, que é uma doença auto-imune2,3. O efeito Ade é mediado pelos anticorpos Cross-Reactive que fazem a ponte para conectar o receptor de DENV e de FC que apresenta pilhas4,5, quando os gravis da miastenia forem causados pelos anticorpos excessivos que atacam receptores da acetilcolina entre as junções célula-célula no tecido muscular6,7. Embora abordagens parcialmente eficazes tenham sido desenvolvidas para tratar essas doenças8,9, semdúvida, a eliminação direta desses anticorpos prejudiciais faria progressos para as intervenções.
Recentemente, as moléculas de DCAF, que têm grupos Dual-functional, foram desenvolvidas para o anticorpo alvejado que obstrui10. DCAF é um peptide longo que seja compor de 3 porções: 1) uma peça do antígeno que possa específico reconhecer o anticorpo cognato, 2) um tag de FC-III ou de FC-III-4C para fortemente ligar à região de FC do anticorpo para inibir o receptor de FC ou as proteínas do componente do complemento , 3) um longo vinculador α-helicoidal que conjuga esses dois grupos funcionais10. A parte do vinculador, projetada do domínio de Moesin FERM, foi aperfeiçoada pelo software de Rosseta para assegurar a parte do antígeno e a parte de FC-III em uma molécula de DCAF pode ligar às regiões de fab e de FC de IgG simultaneamente. Quatro moléculas de DCAF foram sintetizadas para alvejar 4 anticorpos diferentes, entre eles DCAF1 foi usado para eliminar o anticorpo 4G2, que é um anticorpo Cross-Reactive durante a infecção de DENV para contribuir ao efeito do ADE; e DACF4 foi projetado para o resgate de receptores de acetilcolina, bloqueando mab35 anticorpo em miastenia gravis10.
No presente estudo, DCAF1 como exemplo, foram mostrados os protocolos para a síntese da molécula de DCAF e a detecção da interação entre um DCAF e seu anticorpo cognato. O DCAF1 é semisintetizado pela aproximação de NCL11,12,13,14, que conjuga o derivado de hidrazina de um peptide de FC-III e as partes expressadas do linker-antígeno junto. A abordagem NCL tem vantagens significativas sobre a síntese totalmente química e expressão totalmente recombinante para a síntese de DCAF1, porque ambos os métodos levam a baixo rendimento e alto custo. A abordagem atual não é apenas a maneira mais rentável para obter o DCAF de comprimento total, mas também pode manter a conformação da parte do vinculador semelhante como sua forma nativa. Desde que as moléculas diferentes de DCAF têm seqüências similares à exceção das peças do antígeno, nossos métodos para a síntese DCAF1 e o ensaio da interação entre o anticorpo DCAF1 e 4G2 podem ser aplicados a outras moléculas de DCAF ao bloco alvejado seus anticorpos cognato também.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo aqui descreve a semisíntese e a detecção de DCAF1 usando a abordagem NCL, que é mostrada na Figura 1. Resumidamente, os dois fragmentos de DCAF1 são químicos sintetizados e recombinantemente expressos, respectivamente; Então, a molécula cheia do comprimento DCAF1 é montada, modificada e purificada. Para a síntese de fragmento de FC-III derivado de hidrazina, usar resina de baixa capacidade de 2 CL é bastante importante, pois a alta capacidade tem um efeito negativo par…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado em parte pela Universidade Tsinghua-Gates Foundation (não. OPP1021992), a Fundação Nacional da ciência natural de China (no. 21502103, 21877068 e 041301475), e o programa chave nacional da pesquisa e do desenvolvimento de China (no. 2017YFA0505103).
Materials
| 2-Chlorotrityl resin | Tianjin Nankai HECHENG S&T | ||
| 1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridinium hexafluorophosphate 3-oxide | GL Biochem | 00703 | |
| 2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminiumhexafluorophosphate | GL Biochem | 00706 | |
| 2,2′-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride | J&K Scientific | 503236 | |
| 4G2 antibody | Thermo | MA5-24387 | |
| 4-mercaptophenylacetic acid | Alfa Aesar | H27658 | |
| 96-well microtiter plates | NEST | 701001 | |
| Acetonitrile | Thermo-Fisher | A955 | MS Grade |
| AgOAc | Sinopharm Chemical Reagent | 30164324 | |
| anti-GST antibody | Abclonal | AE001 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076P2 | |
| BSA | Beijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL | ||
| CD spectrometer | Applied Photophysics Ltd | ||
| dialysis bag | Sbjbio | SBJ132636 | |
| Dichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent | 80047360 | |
| diethyl ether | Sinopharm Chemical Reagent | 10009318 | |
| DNA Gel Extraction Kit | Beyotime | D0056 | |
| Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo | ||
| GSH Sepharose | GE Lifesciences | ||
| Guanidine hydrochloride | Sinopharm Chemical Reagent | 30095516 | |
| Hydrazine hydrate | Sinopharm Chemical Reagent | 80070418 | |
| Hydrochloric acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10011018 | |
| imidazole | SIGMA | 12399-100G | |
| Isopropyl β-D-Thiogalactoside | SIGMA | 5502-5G | |
| kanamycin | Beyotime | ST101 | |
| Methanol | Thermo-Fisher | A456 | MS Grade |
| N, N-Diisopropylethylamine | GL Biochem | 90600 | |
| N, N-Dimethylformamide | Sinopharm Chemical Reagent | 8100771933 | |
| NcoI | Thermo | ER0571 | |
| PBS buffer | Solarbio | P1022 | |
| Peptide BEH C18 Column | Waters | 186003625 | |
| piperidine | Sinopharm Chemical Reagent | 80104216 | |
| Plasmid Extraction Kit | Sangon Biotech | B611253-0002 | |
| QIAexpress Kit | QIAGEN | 32149 | |
| Rapid DNA Ligation Kit | Beyotime | D7002 | |
| Sodium dihydrogen phosphate dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent | 20040718 | |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent | 10019762 | |
| Sodium nitrite | Sinopharm Chemical Reagent | 10020018 | |
| sodium chloride | Sinopharm Chemical Reagent | 10019318 | |
| Standard Fmoc-protected amino acids | GL Biochem | ||
| sterilizing pot | Tomy | SX-700 | |
| SUMO Protease | Thermo Fisher | 12588018 | |
| stop solution | Biolegend | 423001 | |
| the whole gene sequence that can express SUMO-linker-antigen | Taihe Biotechnology Compay | ||
| TMB reagent | Biolegend | 421101 | |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA | T6508 | |
| Triisopropylsilane | GL Biochem | 91100 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Aladdin | T107252-5g | |
| tryptone | OXOID | LP0042 | |
| Tween 20 | Solarbio | T8220 | |
| Ultimate 3000 HPLC | Thermo | ||
| vacuum pump | YUHUA | SHZ-95B | |
| XhoI | Thermo | IVGN0086 | |
| yeast extract | OXOID | LP0021 |
Riferimenti
- Rhoades, R. A., Pflanzer, R. G. . Human Physiology (4th ed.). , (2003).
- Halstead, S. B., O’Rourke, E. J. Antibody-enhanced dengue virus infection in primate leukocytes. Nature. 265, 739-741 (1977).
- Gammon, G., Sercarz, E. How some T cells escape tolerance induction. Nature. 342, 183-185 (1989).
- Takada, A., Kawaoka, Y. Antibody-dependent enhancement of viral infection: molecular mechanisms and in vivo implications. Reviews in Medical Virology. 13, 387-398 (2003).
- Boonnak, K., et al. Role of Dendritic Cells in Antibody-Dependent Enhancement of Dengue Virus Infection. Journal of Virology. 82, 3939-3951 (2008).
- Gilhus, N. E., Skeie, G. O., Romi, F., Lazaridis, K., Zisimopoulou, P., Tzartos, S. Myasthenia gravis – autoantibody characteristics and their implications for therapy. Nature Reviews neurology. 12, 259 (2016).
- Contifine, B. M., Milani, M., Kaminski, H. J. Myasthenia gravis: past, present, and future. Journal of Clinical Investigation. 116, 2843-2854 (2006).
- Webster, D. P., Farrar, J., Rowland-Jones, S. Progress towards a dengue vaccine. The Lancet Infectious Diseases. 9, 678-687 (2009).
- Vikas, K., Kaminski, H. J. Treatment of Myasthenia Gravis. Current Neurology and Neuroscience Reports. 11, 89-96 (2011).
- Zhang, L., et al. Development of a dual-functional conjugate of antigenic peptide and Fc-III mimetics (DCAF) for targeted antibody blocking. Chemical Science. 10, 3271-3280 (2019).
- Bello, M. S., Rezzonico, R., Righetti, P. G. Use of taylor-aris dispersion for measurement of a solute diffusion coefficient in thin capillaries. Science. 266, 773-776 (1994).
- Fang, G. M., et al. Protein chemical synthesis by ligation of peptide hydrazides. Angewandte Chemie. International Edition. 50, 7645-7649 (2011).
- Fang, G. M., Wang, J. X., Liu, L. Convergent chemical synthesis of proteins by ligation of peptide hydrazides. Angewandte Chemie. International Edition. 51, 10347-10350 (2012).
- Zheng, J. S., Tang, S., Qi, Y. K., Wang, Z. P., Liu, L. Chemical synthesis of proteins using peptide hydrazides as thioester surrogates. Nature Protocols. 8, 2483-2495 (2013).
