Bloqueo de anticuerpos dirigido por un conjugado dual-funcional de péptido antigénico y méticos Fc-III (DCAF)
Summary
El desarrollo de un conjugado dual-funcional de péptido antigénico y miméticos Fc-III (DCAF) es novedoso para la eliminación de anticuerpos dañinos. Aquí, describimos un protocolo detallado para la síntesis de la molécula DCAF1, que puede bloquear selectivamente el anticuerpo 4G2 para eliminar el efecto de mejora dependiente de anticuerpos durante la infección por el virus del dengue.
Abstract
La eliminación de anticuerpos nocivos de los organismos es un enfoque valioso para la intervención de enfermedades asociadas a anticuerpos, como la fiebre hemorrágica del dengue y las enfermedades autoinmunes. Dado que miles de anticuerpos con diferentes epítopos están circulando en la sangre, no se informó ningún método universal, excepto el conjugado dual-funcional de péptido antigénico y miméticos Fc-III (DCAF), dirigidos a anticuerpos dañinos específicos. El desarrollo de moléculas DCAF hace una contribución significativa al progreso de la terapia dirigida, que se demostró para eliminar el efecto de mejora dependiente de anticuerpos (ADE) en un modelo de infección por el virus del dengue (DENV) y para aumentar la acetilcolina actividad del receptor en un modelo de miastenia grave. Aquí, describimos un protocolo para la síntesis de una molécula DCAF (DCAF1), que puede bloquear selectivamente el anticuerpo 4G2 para atenuar el efecto ADE durante la infección por el virus del dengue, e ilustrar la unión del anticuerpo DCAF1 a 4G2 mediante un ensayo ELISA. En nuestro método, DCAF1 se sintetiza por la conjugación de un derivado de la hidrazina de un péptido Fc-III y un recombinante expresado largo-hélice con secuencia antigénica a través de la ligación química nativa (NCL). Este protocolo se ha aplicado con éxito a DCAF1, así como a otras moléculas DCAF para apuntar a sus anticuerpos cognados.
Introduction
Los anticuerpos desempeñan un papel importante en la respuesta inmune humoral para la neutralización de bacterias y virus patógenos1. Sin embargo, algunos anticuerpos presentan impactos nocivos para los organismos, como los anticuerpos reactivos cruzados en el efecto ADE durante la infección por DENV y los anticuerpos sobrerreactivos en la miastenia grave, que es una enfermedad autoinmune2,3. El efecto ADE está mediado por los anticuerpos reactivos cruzados que hacen que el puente para conectar las células de presentación del receptor DENV y Fc4,5, mientras que la miastenia grave es causada por los anticuerpos excesivos que atacan los receptores de acetilcolina entre las uniones celulares en el tejido muscular6,7. Aunque se han desarrollado enfoques parcialmente eficaces para tratar estas enfermedades8,9, sin duda, la eliminación directa de estos anticuerpos nocivos haría progresos para las intervenciones.
Recientemente, las moléculas DCAF, que tienen grupos dual-funcionales, se han desarrollado para el bloqueo de anticuerposdirigidos 10. DCAF es un péptido largo que se compone de 3 partes: 1) una parte de antígeno que puede reconocer específicamente el anticuerpo cognado, 2) una etiqueta Fc-III o Fc-III-4C para unirse fuertemente a la región Fc del anticuerpo para inhibir el receptor Fc o complementar las proteínas componentes , 3) un vinculador largo-helical que conjuga estos dos grupos funcionales10. La parte del vinculador, diseñada a partir del dominio Moesin FERM, fue optimizada por el software Rosseta para asegurar que la parte del antígeno y la parte Fc-III en una molécula DCAF puedan unirse a las regiones Fab y Fc de IgG simultáneamente. Cuatro moléculas DCAF se han sintetizado para apuntar a 4 anticuerpos diferentes, entre ellos DCAF1 se utilizó para eliminar el anticuerpo 4G2, que es un anticuerpo reactivo cruzado durante la infección DENV para contribuir al efecto ADE; y DACF4 fue diseñado para el rescate de receptores de acetilcolina mediante el bloqueo de anticuerpos mab35 en miastenia grave10.
En el presente estudio, tomado DCAF1 como ejemplo, mostramos los protocolos para la síntesis de molécula DCAF y la detección de la interacción entre un DCAF y su anticuerpo cognado. El DCAF1 está semisintetizado por NCL approach11,12,13,14, que conjuga el derivado de la hidrazina de un péptido Fc-III y las partes expresadas del antígeno vinculador. El enfoque NCL tiene ventajas significativas sobre la síntesis totalmente química y la expresión totalmente recombinante para la síntesis DCAF1, porque ambos métodos conducen a un bajo rendimiento y un alto costo. El enfoque actual no sólo es la forma más rentable de obtener el DCAF de longitud completa, sino que también puede mantener la conformación de la parte del vinculador similar a su forma nativa. Dado que las diferentes moléculas dCAF tienen secuencias similares a excepción de las partes del antígeno, nuestros métodos para la síntesis dCAF1 y el ensayo de interacción entre el anticuerpo DCAF1 y 4G2 se pueden aplicar a otras moléculas DCAF a bloques dirigidos también sus anticuerpos cognados.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo aquí describe la semisíntesis y la detección de DCAF1 mediante el enfoque NCL, que se muestra en la Figura 1. En resumen, los dos fragmentos de DCAF1 son sintetizados químicamente y expresados de forma recombinante, respectivamente; entonces, la molécula DCAF1 de longitud completa se ensambla, modifica y purifica. Para la síntesis de fragmentos de Fc-III derivada de la hidrazina, el uso de resina de baja capacidad 2-Cl es bastante importante, porque la alta capacidad tiene…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado en parte por la Fundación Tsinghua University-Gates (no. OPP1021992), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (n. 21502103, 21877068 y 041301475), y el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (n. 2017YFA0505103).
Materials
| 2-Chlorotrityl resin | Tianjin Nankai HECHENG S&T | ||
| 1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridinium hexafluorophosphate 3-oxide | GL Biochem | 00703 | |
| 2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminiumhexafluorophosphate | GL Biochem | 00706 | |
| 2,2′-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride | J&K Scientific | 503236 | |
| 4G2 antibody | Thermo | MA5-24387 | |
| 4-mercaptophenylacetic acid | Alfa Aesar | H27658 | |
| 96-well microtiter plates | NEST | 701001 | |
| Acetonitrile | Thermo-Fisher | A955 | MS Grade |
| AgOAc | Sinopharm Chemical Reagent | 30164324 | |
| anti-GST antibody | Abclonal | AE001 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076P2 | |
| BSA | Beijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL | ||
| CD spectrometer | Applied Photophysics Ltd | ||
| dialysis bag | Sbjbio | SBJ132636 | |
| Dichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent | 80047360 | |
| diethyl ether | Sinopharm Chemical Reagent | 10009318 | |
| DNA Gel Extraction Kit | Beyotime | D0056 | |
| Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo | ||
| GSH Sepharose | GE Lifesciences | ||
| Guanidine hydrochloride | Sinopharm Chemical Reagent | 30095516 | |
| Hydrazine hydrate | Sinopharm Chemical Reagent | 80070418 | |
| Hydrochloric acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10011018 | |
| imidazole | SIGMA | 12399-100G | |
| Isopropyl β-D-Thiogalactoside | SIGMA | 5502-5G | |
| kanamycin | Beyotime | ST101 | |
| Methanol | Thermo-Fisher | A456 | MS Grade |
| N, N-Diisopropylethylamine | GL Biochem | 90600 | |
| N, N-Dimethylformamide | Sinopharm Chemical Reagent | 8100771933 | |
| NcoI | Thermo | ER0571 | |
| PBS buffer | Solarbio | P1022 | |
| Peptide BEH C18 Column | Waters | 186003625 | |
| piperidine | Sinopharm Chemical Reagent | 80104216 | |
| Plasmid Extraction Kit | Sangon Biotech | B611253-0002 | |
| QIAexpress Kit | QIAGEN | 32149 | |
| Rapid DNA Ligation Kit | Beyotime | D7002 | |
| Sodium dihydrogen phosphate dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent | 20040718 | |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent | 10019762 | |
| Sodium nitrite | Sinopharm Chemical Reagent | 10020018 | |
| sodium chloride | Sinopharm Chemical Reagent | 10019318 | |
| Standard Fmoc-protected amino acids | GL Biochem | ||
| sterilizing pot | Tomy | SX-700 | |
| SUMO Protease | Thermo Fisher | 12588018 | |
| stop solution | Biolegend | 423001 | |
| the whole gene sequence that can express SUMO-linker-antigen | Taihe Biotechnology Compay | ||
| TMB reagent | Biolegend | 421101 | |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA | T6508 | |
| Triisopropylsilane | GL Biochem | 91100 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Aladdin | T107252-5g | |
| tryptone | OXOID | LP0042 | |
| Tween 20 | Solarbio | T8220 | |
| Ultimate 3000 HPLC | Thermo | ||
| vacuum pump | YUHUA | SHZ-95B | |
| XhoI | Thermo | IVGN0086 | |
| yeast extract | OXOID | LP0021 |
Riferimenti
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