यह अध्ययन भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं से प्रतिरक्षा उत्तेजक ग्रैनुलोसाइट मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारकों को ले जाने वाले एक्सोसोम-समृद्ध एक्सेलैलरुलर वेसिकल्स को अलग करने की विधि का वर्णन करता है।
भ्रूणस्टेम कोशिकाएं (ईएसएसी) सभी प्रकार की भ्रूणीय कोशिकाओं में आत्म-नवीकरण और भेदभाव करने में सक्षम प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल हैं। कई अन्य सेल प्रकारों की तरह, ईएससी अतिरिक्त पर्यावरण के लिए छोटे झिल्ली वेसिकल्स, जैसे एक्सोसोम्स जारी करते हैं। एक्सोसोम इंटरसेलुलर संचार के आवश्यक मध्यस्थ के रूप में काम करते हैं और कई (पाथो) शारीरिक प्रक्रियाओं में एक बुनियादी भूमिका निभाते हैं। ग्रेनुलोसिटे-मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक (जीएम-सीएसएफ) प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को मिलाने के लिए एक साइटोकिन के रूप में कार्य करता है। एक्सोसोम्स में जीएम-सीएसएफ की उपस्थिति में उनके प्रतिरक्षा-नियामक कार्य को बढ़ावा देने की क्षमता है। यहां, जीएम-सीएसएफ को मुरीन ईएससी सेल लाइन ईएस-डी 3 में स्थिर रूप से अधिक व्यक्त किया गया था। जीएम-सीएसएफ को ओवरएक्सप्रेस करने वाली ईएस-डी3 कोशिकाओं से उच्च गुणवत्ता वाले एक्सोसोम-समृद्ध एक्सोसेलुलर वेसिकल्स (ईवीएस) को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया गया था। अलग एक्सोसोम-समृद्ध ईवीएस को विभिन्न प्रकार के प्रयोगात्मक दृष्टिकोणों की विशेषता थी। महत्वपूर्ण बात यह है कि जीएम-सीएसएफ की महत्वपूर्ण मात्रा एक्सोसोम-समृद्ध ईवीएस में मौजूद पाई गई । कुल मिलाकर, ईएसएसी से जीएम-सीएसएफ-असर एक्सोसोम-समृद्ध ईवीएस अपनी प्रतिरक्षा-नियामक गतिविधियों को लागू करने के लिए सेल-मुक्त वेसिकल्स के रूप में कार्य कर सकते हैं।
ईएससी एक प्रीइम्प्लांटेशन भ्रूण के ब्लास्टोसिस्ट चरण से प्राप्त होते हैं1. प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल के रूप में, ईएसएससी के पास किसी भी प्रकार की भ्रूणीय कोशिका में आत्म-नवीनीकरण और अंतर करने की क्षमता है। उनकी उल्लेखनीय विकासात्मक क्षमता और दीर्घकालिक प्रसार क्षमता के कारण, ईएसएसी जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए अत्यंत मूल्यवान हैं1। वर्तमान अनुसंधान प्रयासों ने मधुमेह, हृदय रोग और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों सहित विभिन्न प्रमुख रोग विकारों के लिए ईएसएसी की चिकित्सीय क्षमता पर काफी हद तक ध्यान केंद्रित किया है2,3,4।
ईएससी सहित स्तनधारी कोशिकाओं को बाह्य पर्यावरण के लिए चर आकारों के साथ वेसिकल्स जारी करने के लिए जाना जाता है, और इन ईवीएस में अंतरकोशिकीय संचार5में उनकी भूमिका के कारण कई शारीरिक और रोग कार्य होते हैं। ईवीएस के विभिन्न उपप्रकारों में, एक्सोसोम्स प्लाज्मा झिल्ली6के साथ मध्यवर्ती एंडोसाइटिक डिब्बों, मल्टीवेस्कुलर निकायों (एमवीबी) के संलयन पर विभिन्न सेल प्रकारों से बाह्य अंतरिक्ष में जारी छोटे झिल्ली वेसिकल्स हैं। एक्सोसोम्स को अंतरकोशिकीय संचार में मध्यस्थता करने के लिए सूचित किया गया है और कई (पाथो) शारीरिक प्रक्रियाओं में गंभीर रूप से शामिल हैं7,8। एक्सोसोम्स अपने स्वयं के माता-पिता की कोशिकाओं से कुछ जैविक कार्यों के वारिस हैं, क्योंकि एक्सोसोम्स में प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड सहित साइटोसोल से प्राप्त जैविक सामग्री होती है। इस प्रकार, किसी दिए गए रोग के लिए विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को उत्तेजित करने वाले संबंधित एंटीजन या कारकों को विशेष प्रकार की कोशिकाओं से एक्सोसोम्स में समझाया जाता है9। यह एक कैंसर विरोधी वैक्सीन10के रूप में ट्यूमर व्युत्पन्न एक्सोसोम्स की खोज नैदानिक परीक्षणों के लिए मार्ग प्रशस्त किया ।
जीएम-सीएसएफ एक साइटोकिन है जो विभिन्न प्रकार की प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा स्रावित किया जाता है11। उभरते सबूत दर्शाता है कि जीएम-CSF सक्रिय और प्रतिरक्षा प्रणाली को नियंत्रित करता है और एंटीजन पेश करने की प्रक्रिया12में एक आवश्यक भूमिका निभाता है । उदाहरण के लिए, एक नैदानिक रिपोर्ट से पता चलता है कि जीएम-सीएसएफ ट्यूमर के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को एक टीका एडजुवेंट13के रूप में उत्तेजित करता है । जीएम-सीएसएफ की शक्तिशाली प्रतिरक्षा-उत्तेजक गतिविधि का फायदा उठाने के लिए कई जीएम-सीएसएफ आधारित कैंसर इम्यूनोथेरेपी रणनीतियों की नैदानिक परीक्षणों में जांच की गई है14। इनमें से, विकिरणित जीएम-सीएसएफ-स्राव ट्यूमर कोशिकाओं से बना एक कैंसर टीका ने उन्नत मेलानोमा रोगियों में सेलुलर और विनोदी एंटीट्यूमर प्रतिक्रियाओं और मेटास्टेसाइज्ड ट्यूमर15में बाद में परिगलन को प्रेरित करके कुछ वादा दिखाया है ।
क्योंकि ईएससी से प्राप्त एक्सोसोम्स में मूल ईएससी के रूप में समान जैविक गतिविधियां होती हैं, शायद जीएम-सीएसएफ-ईएसएक्स से एक्सोसोम ले जाने से प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को विनियमित करने के लिए सेल-मुक्त वेसिकल्स के रूप में कार्य हो सकता है। इस पत्र में, जीएम-सीएसएफ को व्यक्त करने वाले ईएससी से उच्च गुणवत्ता वाले एक्सोसोम-समृद्ध ईवीएस का उत्पादन करने के लिए एक विस्तृत विधि का वर्णन किया गया है। इन एक्सोसोम-समृद्ध ईवीएस में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को मिलाने के लिए प्रतिरक्षा-नियामक वेसिकल्स के रूप में सेवा करने की क्षमता है।
यह अध्ययन प्रतिरक्षा-उत्तेजक प्रोटीन जीएम-सीएसएफ को ले जाने वाले एक्सोसोम-समृद्ध ईवीएस के उत्पादन की एक अत्यधिक कुशल विधि दिखाता है, जिसे एक्सोसोम-समृद्ध ईवीएस के प्रतिरक्षा-मॉड्यूलरी प्रभावों का अ?…
The authors have nothing to disclose.
हम ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप छवियों को प्राप्त करने के लिए श्री आर्कादिउज़ स्लुसारसीज़िक और केंटकी बायोमेडिकल रिसर्च इंफ्रास्ट्रक्चर नेटवर्क (KBRIN, P20GM103436) के आभारी हैं। इस काम के हिस्से में NIH AA018016-01 (J.W.E.), केंटकी रिसर्च चैलेंज ट्रस्ट फंड (J.W.E.), NIH CA106599 और CA175003 (C.L.), NIH CA198249 (K.Y.), और मुक्त सांस अनुसंधान अनुदान (K.Y.) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ।
Alkaline phosphate, Calf Intestinal | New England Biolabs | M0290S | Dephosphorylating DNA plasmid |
anti-Annexin V mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone H-3, sc-74438 | Western blot, RRID:AB_1118989 |
anti-CD81 mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone B-11, sc-166029 | Western blot, RRID:AB_2275892 |
anti-cytochrome c mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone A-8, sc-13156 | Western blot, RRID:AB_627385 |
anti-Flotillin-1 mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone C-2; sc-74566 | Western blot, RRID:AB_2106563 |
anti-GAPDH pAb | Rockland | 600-401-A33S | Western blot, RRID:AB_11182910 |
anti-mouse IgG, goat, peroxidase-conjugated | Thermo Fisher | 31430 | Western blot, RRID:AB_228307 |
anti-Oxphos COX IV-subunit IV mAb | Thermo Fisher | clone 20E8C12 A21348 | Western blot, RRID:AB_221509 |
anti-protein disulfide isomerase (PDI) pAb | Enzo | ADI-SPA-890 | Western blot, RRID:AB_10616242 |
anti-rabbit IgG, goat, peroxidase-conjugated | Thermo Fisher | 31460 | Western blot, RRID:AB_228341 |
BCA (bicinchoninic acid) assay | Thermo Fisher | 23223 | Determining protein concentrations |
Bis-Tris PAGE Gel, ExpressPlus, 4-20% | Genscript | M42015 | Western blot |
Carbenicillin, Disodium Salt | Thermo Fisher | 10177012 | Selecting E. coli colonies |
Centrifuge, Avanti J-26 XPI | Beckman Coulter | Low speed centrifugation | |
Centrifuge rotor, JA-10 | Beckman Coulter | 09U1597 | Low speed centrifugation |
Centrifuge bottle, Nalgene PPCO | Thermo Fisher | 3120-0500PK | Low speed centrifugation |
Cu grids with carbon support film | Electron Microscopy Sciences | FF200-Cu | Acquiring electron microscopy images |
EcoRI | New England Biolabs | R0101 | Digesting DNA plasmid |
Enhanced chemiluminescence detection system | Thermo Fisher | 32106 | Western blot |
FACScalibur flow cytometer | Becton Dickinson | Examining GFP levels of ES-D3 cells | |
Fetal bovine serum | ATCC | SCRR-30-2020 | Medium for ES-D3 cells |
Fisherbrand Sterile Cell Strainers; Mesh Size: 40μm | Thermo Fisher | 22-363-547 | Filtering ES-D3 cells for FACS sorting |
Gelatin (0.1%) | Thermo Fisher | ES006B | Culturing ES-D3 cells |
GM-CSF ELISA kit | Thermo Fisher | 88733422 | Determining GM-CSF concentrations |
KnockOut Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Thermo Fisher | 10-829-018 | Medium for ES-D3 cells |
Leukemia Inhibitory Factor | Thermo Fisher | ESG1106 | Medium for ES-D3 cells |
L-glutamine | VWR | VWRL0131-0100 | Medium for ES-D3 cells |
Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher | 11668019 | Transfecting ES-D3 cells |
Microplate reader, PowerWave XS | BioTek | Determining GM-CSF concentrations | |
MoFlo XDP high-speed cell sorter | Beckman Coulter | Isolating single ES-D3 cell clones | |
NEB 5-alpha Competent E. coli | New England Biolabs | C2988J | Generating GM-CSF expression plasmid |
Neomycin | Thermo Fisher | 10-131-035 | Selecting ES-D3 clones |
Non-essential amino acids | Thermo Fisher | SH3023801 | Medium for ES-D3 cells |
Non-fat dry milk | Thermo Fisher | NC9022655 | Western blot |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 | Transfecting ES-D3 cells |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Acquiring electron microscopy images |
Penicillin/streptomycin | VWR | sc45000-652 | Medium for ES-D3 cells |
Plasmid pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFP | Addgene | 37270 | Generating GM-CSF expression plasmid |
PVDF membranes | Millipore EMD | IPVH00010 | Western blot |
QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | Generating GM-CSF expression plasmid |
QIAquick Gel Extraction Kit (50) | QIAGEN | 28704 | Generating GM-CSF expression plasmid |
Quick Ligation Kit | New England Biolabs | M2200S | Generating GM-CSF expression plasmid |
Transmission electron microscope | Hitachi | HT7700 | Acquiring electron microscopy images |
Trypsin | VWR | 45000-660 | Culturing ES-D3 cells |
Ultracentrifuge, OptimaTM L-100 XP | Beckman Coulter | High speed centrifugation | |
Ultracentrifuge rotor, 45Ti | Beckman Coulter | 09U4454 | High speed centrifugation |
Ultracentrifuge polycarbonate bottle | Beckman Coulter | 355622 | High speed centrifugation |
UranyLess staining solution | Electron Microscopy Sciences | 22409 | Acquiring electron microscopy images |