Isolierung von exosomenangereicherten extrazellulären Vesikeln, die Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor aus embryonalen Stammzellen tragen
Summary
Diese Studie beschreibt eine Methode zur Isolierung von exosomenangereicherten extrazellulären Vesikeln, die immunstimulierende Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktoren aus embryonalen Stammzellen tragen.
Abstract
Embryonale Stammzellen (ESCs) sind pluripotente Stammzellen, die sich selbst erneuern und in alle Arten von embryonalen Zellen differenzieren können. Wie viele andere Zelltypen setzen ESCs kleine Membranvesikel wie Exosomen an die extrazelluläre Umgebung frei. Exosomen dienen als essentielle Mediatoren der interzellulären Kommunikation und spielen eine grundlegende Rolle in vielen (patho)physiologischen Prozessen. Der Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (GM-CSF) fungiert als Zytokin, um die Immunantwort zu modulieren. Das Vorhandensein von GM-CSF in Exosomen hat das Potenzial, ihre immunregulatorische Funktion zu stärken. Hier wurde GM-CSF in der murinen ESC-Zelllinie ES-D3 stabil überexprimiert. Es wurde ein Protokoll entwickelt, um hochwertige exosomenangereicherte extrazelluläre Vesikel (EVs) aus ES-D3-Zellen zu isolieren, die GM-CSF überexprimieren. Isolierte exosomenangereicherte EVs wurden durch eine Vielzahl von experimentellen Ansätzen charakterisiert. Wichtig ist, dass signifikante Mengen an GM-CSF in exosomenangereicherten Elektrofahrzeugen vorhanden sind. Insgesamt könnten GV-CSF-tragende Exosomen-angereicherte EVs aus ESCs als zellfreie Vesikel fungieren, um ihre immunregulatorischen Aktivitäten auszuüben.
Introduction
ESCs werden aus dem Blastozystenstadium eines Präimplantationsembrionsembrosabgeleitet 1. Als pluripotente Stammzellen haben ESCs die Fähigkeit, sich selbst zu erneuern und sich in jede Art von embryonalen Zellen zu differenzieren. Aufgrund ihres bemerkenswerten Entwicklungspotenzials und ihrer langfristigen Proliferationsfähigkeit sind ESCs für die biomedizinische Forschung äußerst wertvoll1. Aktuelle Forschungsbemühungen haben sich weitgehend auf das therapeutische Potenzial von ESCs für eine Vielzahl von schweren pathologischen Erkrankungen konzentriert, einschließlich Diabetes, Herzerkrankungen und neurodegenerative Erkrankungen2,3,4.
Es ist bekannt, dass Säugetierzellen, einschließlich ESCs, Vesikel mit unterschiedlicher Größe an die extrazelluläre Umgebung abgeben, und diese EVs besitzen aufgrund ihrer Rolle in der interzellulären Kommunikation viele physiologische und pathologische Funktionen5. Unter den verschiedenen Subtypen von EVs sind Exosomen kleine Membranvesikel, die bei der Fusion von intermediären endozytären Kompartimenten, multivesikulären Körpern (MVBs), mit der Plasmamembran von verschiedenen Zelltypen in den extrazellulären Raum freigesetzt werden6. Es wurde berichtet, dass Exosomen interzelluläre Kommunikation vermitteln und an vielen (patho)physiologischen Prozessen beteiligt sind7,8. Exosomen erben einige biologische Funktionen von ihren eigenen Elternzellen, da Exosomen biologische Materialien enthalten, die aus dem Zytosol gewonnen werden, einschließlich Proteine und Nukleinsäuren. So werden die assoziierten Antigene oder Faktoren, die die für eine bestimmte Krankheit spezifische Immunantwort stimulieren, in den Exosomen bestimmter Zelltypen eingekapselt9. Dies ebnete den Weg für klinische Studien, in die tumorabgeleitete Exosomen als Krebsimpfstoff untersucht wurden10.
GM-CSF ist ein Zytokin, das von verschiedenen Arten von Immunzellen abgesondert wird11. Neue Erkenntnisse zeigen, dass GM-CSF das Immunsystem aktiviert und reguliert und eine wesentliche Rolle im Antigen-Präsentationsprozess spielt12. Zum Beispiel legt ein klinischer Bericht nahe, dass GM-CSF die Immunantwort auf Tumore als Impfstoffadjuvans stimuliert13. Mehrere GM-CSF-basierte Krebsimmuntherapiestrategien, um die starke immunstimulierende Aktivität von GM-CSF zu nutzen, wurden in klinischen Studien untersucht14. Unter diesen hat sich ein Krebsimpfstoff, der aus bestrahlten GM-CSF-sezernierenden Tumorzellen besteht, bei fortgeschrittenen Melanompatienten als vielversprechend erwiesen, indem er zelluläre und humorale Antitumorreaktionen und anschließende Nekrose bei metastasierten Tumoren induziert15.
Da die aus ESCs gewonnenen Exosomen ähnliche biologische Aktivitäten besitzen wie die ursprünglichen ESCs, könnten GM-CSF-tragende Exosomen aus ESCs als zellfreie Vesikel fungieren, um die Immunantwort zu regulieren. In diesem Artikel wird eine detaillierte Methode zur Herstellung hochwertiger exosomenangereicherter EVs aus ESCs beschrieben, die GM-CSF exprimieren. Diese exosomenangereicherten EVs haben das Potenzial, als immunregulatorische Vesikel zu dienen, um die Immunantwort zu modulieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Studie zeigt eine hocheffiziente Methode zur Herstellung von exosomenangereicherten EVs, die das immunstimulierende Protein GM-CSF tragen, das zur Untersuchung der immunmodulatorischen Wirkungen von exosomenangereicherten EVs eingesetzt werden kann. Mehrere Studien deuten darauf hin, dass Exosomen immunregulatorische und Anti-Tumor-Funktionen aufweisen22. So könnten Exosomen aus ESCs, die GV-CSF exprimieren, auch biologische Aktivitäten besitzen, die die Immunantwort regulieren. In diesem …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Herrn Arkadiusz Slusarczyk und dem Kentucky Biomedical Research Infrastructure Network (KBRIN, P20GM103436) für die Erfassung von Transmissionselektronenmikroskopischen Bildern. Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse von NIH AA018016-01 (J.W.E.), Commonwealth of Kentucky Research Challenge Trust Fund (J.W.E.), NIH CA106599 und CA175003 (C.L.), NIH CA198249 (K.Y.) und Free to Breathe Research Grant (K.Y.) unterstützt.
Materials
| Alkaline phosphate, Calf Intestinal | New England Biolabs | M0290S | Dephosphorylating DNA plasmid |
| anti-Annexin V mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone H-3, sc-74438 | Western blot, RRID:AB_1118989 |
| anti-CD81 mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone B-11, sc-166029 | Western blot, RRID:AB_2275892 |
| anti-cytochrome c mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone A-8, sc-13156 | Western blot, RRID:AB_627385 |
| anti-Flotillin-1 mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone C-2; sc-74566 | Western blot, RRID:AB_2106563 |
| anti-GAPDH pAb | Rockland | 600-401-A33S | Western blot, RRID:AB_11182910 |
| anti-mouse IgG, goat, peroxidase-conjugated | Thermo Fisher | 31430 | Western blot, RRID:AB_228307 |
| anti-Oxphos COX IV-subunit IV mAb | Thermo Fisher | clone 20E8C12 A21348 | Western blot, RRID:AB_221509 |
| anti-protein disulfide isomerase (PDI) pAb | Enzo | ADI-SPA-890 | Western blot, RRID:AB_10616242 |
| anti-rabbit IgG, goat, peroxidase-conjugated | Thermo Fisher | 31460 | Western blot, RRID:AB_228341 |
| BCA (bicinchoninic acid) assay | Thermo Fisher | 23223 | Determining protein concentrations |
| Bis-Tris PAGE Gel, ExpressPlus, 4-20% | Genscript | M42015 | Western blot |
| Carbenicillin, Disodium Salt | Thermo Fisher | 10177012 | Selecting E. coli colonies |
| Centrifuge, Avanti J-26 XPI | Beckman Coulter | Low speed centrifugation | |
| Centrifuge rotor, JA-10 | Beckman Coulter | 09U1597 | Low speed centrifugation |
| Centrifuge bottle, Nalgene PPCO | Thermo Fisher | 3120-0500PK | Low speed centrifugation |
| Cu grids with carbon support film | Electron Microscopy Sciences | FF200-Cu | Acquiring electron microscopy images |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101 | Digesting DNA plasmid |
| Enhanced chemiluminescence detection system | Thermo Fisher | 32106 | Western blot |
| FACScalibur flow cytometer | Becton Dickinson | Examining GFP levels of ES-D3 cells | |
| Fetal bovine serum | ATCC | SCRR-30-2020 | Medium for ES-D3 cells |
| Fisherbrand Sterile Cell Strainers; Mesh Size: 40μm | Thermo Fisher | 22-363-547 | Filtering ES-D3 cells for FACS sorting |
| Gelatin (0.1%) | Thermo Fisher | ES006B | Culturing ES-D3 cells |
| GM-CSF ELISA kit | Thermo Fisher | 88733422 | Determining GM-CSF concentrations |
| KnockOut Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Thermo Fisher | 10-829-018 | Medium for ES-D3 cells |
| Leukemia Inhibitory Factor | Thermo Fisher | ESG1106 | Medium for ES-D3 cells |
| L-glutamine | VWR | VWRL0131-0100 | Medium for ES-D3 cells |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher | 11668019 | Transfecting ES-D3 cells |
| Microplate reader, PowerWave XS | BioTek | Determining GM-CSF concentrations | |
| MoFlo XDP high-speed cell sorter | Beckman Coulter | Isolating single ES-D3 cell clones | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England Biolabs | C2988J | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Neomycin | Thermo Fisher | 10-131-035 | Selecting ES-D3 clones |
| Non-essential amino acids | Thermo Fisher | SH3023801 | Medium for ES-D3 cells |
| Non-fat dry milk | Thermo Fisher | NC9022655 | Western blot |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 | Transfecting ES-D3 cells |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Acquiring electron microscopy images |
| Penicillin/streptomycin | VWR | sc45000-652 | Medium for ES-D3 cells |
| Plasmid pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFP | Addgene | 37270 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| PVDF membranes | Millipore EMD | IPVH00010 | Western blot |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| QIAquick Gel Extraction Kit (50) | QIAGEN | 28704 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Quick Ligation Kit | New England Biolabs | M2200S | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Transmission electron microscope | Hitachi | HT7700 | Acquiring electron microscopy images |
| Trypsin | VWR | 45000-660 | Culturing ES-D3 cells |
| Ultracentrifuge, OptimaTM L-100 XP | Beckman Coulter | High speed centrifugation | |
| Ultracentrifuge rotor, 45Ti | Beckman Coulter | 09U4454 | High speed centrifugation |
| Ultracentrifuge polycarbonate bottle | Beckman Coulter | 355622 | High speed centrifugation |
| UranyLess staining solution | Electron Microscopy Sciences | 22409 | Acquiring electron microscopy images |
References
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