Isolamento di vescicole extracellulari arricchite con esosomi che trasportano il fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi da cellule staminali embrionali
Summary
Questo studio descrive un metodo per isolare vescicole extracellulari arricchite di esosomi che trasportano fattori di stimolazione delle colonie di macrofagi dei granulociti immunostimoltori da cellule staminali embrionali.
Abstract
Le cellule staminali embrionali (ESC) sono cellule staminali pluripotenti in grado di auto-rinnovarsi e differenziarsi in tutti i tipi di cellule embrionali. Come molti altri tipi di cellule, le ESC rilasciano piccole vescicole di membrana, come gli esosomi, nell’ambiente extracellulare. Gli esosomi fungono da mediatori essenziali della comunicazione intercellulare e svolgono un ruolo fondamentale in molti processi (pato)fisiologici. Il fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF) funziona come una citochina per modulare la risposta immunitaria. La presenza di GM-CSF negli esosomi ha il potenziale per aumentare la loro funzione immuno-regolatoria. Qui, GM-CSF è stato stabilmente sovraespresso nella linea cellulare murina ESC ES-D3. È stato sviluppato un protocollo per isolare vescicole extracellulari (EV) arricchite di esosomi di alta qualità da cellule ES-D3 che sovraesprimono GM-CSF. I veicoli elettrici isolati arricchiti di esosomi erano caratterizzati da una varietà di approcci sperimentali. È importante sottolineare che quantità significative di GM-CSF sono risultate presenti nei veicoli elettrici arricchiti di esosomi. Nel complesso, i veicoli elettrici arricchiti di esosomi contenenti GM-CSF provenienti da ESC potrebbero funzionare come vescicole prive di cellule per esercitare le loro attività di immunoregolamentazione.
Introduction
Le ESC sono derivate dallo stadio di blastocisti di un embrione preimpianto1. Come cellule staminali pluripotenti, le SC hanno la capacità di auto-rinnovarsi e differenziarsi in qualsiasi tipo di cellula embrionale. Grazie al loro notevole potenziale di sviluppo e alla capacità proliferativa a lungo termine, le SC sono estremamente preziose per la ricerca biomedica1. Gli attuali sforzi di ricerca si sono in gran parte concentrati sul potenziale terapeutico delle ESC per una varietà di importanti disturbi patologici, tra cui diabete, malattie cardiache e malattie neurodegenerative2,3,4.
Le cellule di mammifero, comprese le ESC, sono note per rilasciare vescicole di dimensioni variabili nell’ambiente extracellulare e queste EV possiedono molte funzioni fisiologiche e patologiche a causa del loro ruolo nella comunicazione intercellulare5. Tra i diversi sottotipi di EV, gli esosomi sono piccole vescicole di membrana rilasciate da vari tipi di cellule nello spazio extracellulare dopo la fusione di compartimenti endocitici intermedi, corpi multivesicolari (MVB), con la membranaplasmatica 6. Gli esosomi sono stati segnalati per mediare la comunicazione intercellulare e sono criticamente coinvolti in molti processi (pato)fisiologici7,8. Gli esosomi ereditano alcune funzioni biologiche dalle proprie cellule parentali, perché gli esosomi contengono materiali biologici acquisiti dal citosol, tra cui proteine e acidi nucleici. Pertanto, gli antigeni associati o i fattori che stimolano la risposta immunitaria specifica per una data malattia sono incapsulati negli esosomi di particolari tipi di cellule9. Ciò ha spianato la strada a studi clinici che esplorano gli esosomi derivati dal tumore come vaccino anti-cancro10.
GM-CSF è una citochina secreta da diversi tipi di cellule immunitarie11. Prove emergenti dimostrano che GM-CSF attiva e regola il sistema immunitario e svolge un ruolo essenziale nel processo di presentazione dell’antigene12. Ad esempio, un rapporto clinico suggerisce che GM-CSF stimola la risposta immunitaria ai tumori come adiuvantevaccinale 13. Diverse strategie di immunoterapia del cancro basate su GM-CSF per sfruttare la potente attività immunostimolante di GM-CSF sono state studiate in studi clinici14. Tra questi, un vaccino antitumorale composto da cellule tumorali secrete di GM-CSF irradiate ha mostrato qualche promessa nei pazienti con melanoma avanzato inducendo risposte antitumorali cellulari e umorali e successiva necrosi nei tumori metastatizzati15.
Poiché gli esosomi derivati dalle ESC possiedono attività biologiche simili a quelli delle ESC originali, forse gli esosomi portatori di GM-CSF da ESC potrebbero funzionare come vescicole prive di cellule per regolare la risposta immunitaria. In questo documento, viene descritto un metodo dettagliato per produrre veicoli elettrici arricchiti di esosomi di alta qualità da ESC che esprimono GM-CSF. Questi veicoli elettrici arricchiti di esosomi hanno il potenziale per fungere da vescicole immunoregolatrici per modulare la risposta immunitaria.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo studio mostra un metodo altamente efficiente per produrre EV arricchiti di esosomi che trasportano la proteina immunostimolante GM-CSF, che può essere impiegata per studiare gli effetti immunomodulanti dei veicoli elettrici arricchiti di esosomi. Diversi studi suggeriscono che gli esosomi esibiscono funzioni immuno-regolatorie eantitumorali 22. Pertanto, gli esosomi delle ESC che esprimono GM-CSF potrebbero anche possedere attività biologiche che regolano la risposta immunitaria. In quest…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati al signor Arkadiusz Slusarczyk e al Kentucky Biomedical Research Infrastructure Network (KBRIN, P20GM103436) per l’acquisizione di immagini al microscopio elettronico a trasmissione. Questo lavoro è stato supportato in parte da sovvenzioni di NIH AA018016-01 (J.W.E.), Commonwealth of Kentucky Research Challenge Trust Fund (J.W.E.), NIH CA106599 e CA175003 (C.L.), NIH CA198249 (K.Y.) e Free to Breathe Research Grant (K.Y.).
Materials
| Alkaline phosphate, Calf Intestinal | New England Biolabs | M0290S | Dephosphorylating DNA plasmid |
| anti-Annexin V mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone H-3, sc-74438 | Western blot, RRID:AB_1118989 |
| anti-CD81 mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone B-11, sc-166029 | Western blot, RRID:AB_2275892 |
| anti-cytochrome c mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone A-8, sc-13156 | Western blot, RRID:AB_627385 |
| anti-Flotillin-1 mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone C-2; sc-74566 | Western blot, RRID:AB_2106563 |
| anti-GAPDH pAb | Rockland | 600-401-A33S | Western blot, RRID:AB_11182910 |
| anti-mouse IgG, goat, peroxidase-conjugated | Thermo Fisher | 31430 | Western blot, RRID:AB_228307 |
| anti-Oxphos COX IV-subunit IV mAb | Thermo Fisher | clone 20E8C12 A21348 | Western blot, RRID:AB_221509 |
| anti-protein disulfide isomerase (PDI) pAb | Enzo | ADI-SPA-890 | Western blot, RRID:AB_10616242 |
| anti-rabbit IgG, goat, peroxidase-conjugated | Thermo Fisher | 31460 | Western blot, RRID:AB_228341 |
| BCA (bicinchoninic acid) assay | Thermo Fisher | 23223 | Determining protein concentrations |
| Bis-Tris PAGE Gel, ExpressPlus, 4-20% | Genscript | M42015 | Western blot |
| Carbenicillin, Disodium Salt | Thermo Fisher | 10177012 | Selecting E. coli colonies |
| Centrifuge, Avanti J-26 XPI | Beckman Coulter | Low speed centrifugation | |
| Centrifuge rotor, JA-10 | Beckman Coulter | 09U1597 | Low speed centrifugation |
| Centrifuge bottle, Nalgene PPCO | Thermo Fisher | 3120-0500PK | Low speed centrifugation |
| Cu grids with carbon support film | Electron Microscopy Sciences | FF200-Cu | Acquiring electron microscopy images |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101 | Digesting DNA plasmid |
| Enhanced chemiluminescence detection system | Thermo Fisher | 32106 | Western blot |
| FACScalibur flow cytometer | Becton Dickinson | Examining GFP levels of ES-D3 cells | |
| Fetal bovine serum | ATCC | SCRR-30-2020 | Medium for ES-D3 cells |
| Fisherbrand Sterile Cell Strainers; Mesh Size: 40μm | Thermo Fisher | 22-363-547 | Filtering ES-D3 cells for FACS sorting |
| Gelatin (0.1%) | Thermo Fisher | ES006B | Culturing ES-D3 cells |
| GM-CSF ELISA kit | Thermo Fisher | 88733422 | Determining GM-CSF concentrations |
| KnockOut Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Thermo Fisher | 10-829-018 | Medium for ES-D3 cells |
| Leukemia Inhibitory Factor | Thermo Fisher | ESG1106 | Medium for ES-D3 cells |
| L-glutamine | VWR | VWRL0131-0100 | Medium for ES-D3 cells |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher | 11668019 | Transfecting ES-D3 cells |
| Microplate reader, PowerWave XS | BioTek | Determining GM-CSF concentrations | |
| MoFlo XDP high-speed cell sorter | Beckman Coulter | Isolating single ES-D3 cell clones | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England Biolabs | C2988J | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Neomycin | Thermo Fisher | 10-131-035 | Selecting ES-D3 clones |
| Non-essential amino acids | Thermo Fisher | SH3023801 | Medium for ES-D3 cells |
| Non-fat dry milk | Thermo Fisher | NC9022655 | Western blot |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 | Transfecting ES-D3 cells |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Acquiring electron microscopy images |
| Penicillin/streptomycin | VWR | sc45000-652 | Medium for ES-D3 cells |
| Plasmid pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFP | Addgene | 37270 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| PVDF membranes | Millipore EMD | IPVH00010 | Western blot |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| QIAquick Gel Extraction Kit (50) | QIAGEN | 28704 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Quick Ligation Kit | New England Biolabs | M2200S | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Transmission electron microscope | Hitachi | HT7700 | Acquiring electron microscopy images |
| Trypsin | VWR | 45000-660 | Culturing ES-D3 cells |
| Ultracentrifuge, OptimaTM L-100 XP | Beckman Coulter | High speed centrifugation | |
| Ultracentrifuge rotor, 45Ti | Beckman Coulter | 09U4454 | High speed centrifugation |
| Ultracentrifuge polycarbonate bottle | Beckman Coulter | 355622 | High speed centrifugation |
| UranyLess staining solution | Electron Microscopy Sciences | 22409 | Acquiring electron microscopy images |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Sakthiswary, R., Raymond, A. A. Stem cell therapy in neurodegenerative diseases: From principles to practice. Neural Regeneration Research. 7 (23), 1822-1831 (2012).
- Liu, Y. W., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates. Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).
- Aguayo-Mazzucato, C., Bonner-Weir, S. Stem cell therapy for type 1 diabetes mellitus. Nature Reviews: Endocrinology. 6 (3), 139-148 (2010).
- Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Current Biology. 28 (8), R435-R444 (2018).
- Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles. Journal of Control Release. 244 (Pt B), 167-183 (2016).
- Lindenbergh, M. F. S., Stoorvogel, W. Antigen Presentation by Extracellular Vesicles from Professional Antigen-Presenting Cells. Annual Review of Immunology. 36, 435-459 (2018).
- Kunigelis, K. E., Graner, M. W. The Dichotomy of Tumor Exosomes (TEX) in Cancer Immunity: Is It All in the ConTEXt?. Vaccines (Basel). 3 (4), 1019-1051 (2015).
- Becher, B., Tugues, S., Greter, M. GM-CSF: From Growth Factor to Central Mediator of Tissue Inflammation. Immunity. 45 (5), 963-973 (2016).
- Conti, L., Gessani, S. GM-CSF in the generation of dendritic cells from human blood monocyte precursors: recent advances. Immunobiology. 213 (9-10), 859-870 (2008).
- Higano, C. S., et al. Integrated data from 2 randomized, double-blind, placebo-controlled, phase 3 trials of active cellular immunotherapy with sipuleucel-T in advanced prostate cancer. Cancer. 115 (16), 3670-3679 (2009).
- Yan, W. L., Shen, K. Y., Tien, C. Y., Chen, Y. A., Liu, S. J. Recent progress in GM-CSF-based cancer immunotherapy. Immunotherapy. 9 (4), 347-360 (2017).
- Dranoff, G., et al. Vaccination with irradiated tumor cells engineered to secrete murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor stimulates potent, specific, and long-lasting anti-tumor immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (8), 3539-3543 (1993).
- Tremml, G., Singer, M., Malavarca, R. Chapter 1, Unit 1C 4, Culture of mouse embryonic stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2008).
- Kirsch, P., Hafner, M., Zentgraf, H., Schilling, L. Time course of fluorescence intensity and protein expression in HeLa cells stably transfected with hrGFP. Molecules and Cells. 15 (3), 341-348 (2003).
- Zeng, X., et al. Stable expression of hrGFP by mouse embryonic stem cells: promoter activity in the undifferentiated state and during dopaminergic neural differentiation. Stem Cells. 21 (6), 647-653 (2003).
- Yaddanapudi, K., et al. Vaccination with embryonic stem cells protects against lung cancer: is a broad-spectrum prophylactic vaccine against cancer possible?. PLoS One. 7 (7), e42289 (2012).
- Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods. 33 (2), 95-103 (2004).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Chapter 3, Unit 3 22, Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , (2006).
- Zhang, X., et al. Exosomes for Immunoregulation and Therapeutic Intervention in Cancer. Journal of Cancer. 7 (9), 1081-1087 (2016).
- Bunggulawa, E. J., et al. Recent advancements in the use of exosomes as drug delivery systems. Journal of Nanobiotechnology. 16 (1), 81 (2018).
- Schlesinger, S., Lee, A. H., Wang, G. Z., Green, L., Goff, S. P. Proviral silencing in embryonic cells is regulated by Yin Yang 1. Cell Reports. 4 (1), 50-58 (2013).
- Dranoff, G. GM-CSF-based cancer vaccines. Immunological Reviews. 188, 147-154 (2002).
- Park, Y. G., et al. Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In Vitro. Development and Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).
- Lin, S., Talbot, P. Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells. Methods in Molecular Biology. 690, 31-56 (2011).
- Yaddanapudi, K., et al. Exosomes from GM-CSF expressing embryonic stem cells are an effective prophylactic vaccine for cancer prevention. OncoImmunology. 8 (3), 1561119 (2019).
