Isolering av exosome-beriket ekstracellulære vesikler som bærer granulocytt-makrofag kolonistimulerende faktor fra embryonale stamceller
Summary
Denne studien beskriver en metode for å isolere eksosomberikede ekstracellulære vesikler som bærer immunstimulatorisk granulocytt makrofagkolonistimulerende faktorer fra embryonale stamceller.
Abstract
Embryonale stamceller (ESC) er pluripotente stamceller som er i stand til selvfornyelse og differensiering i alle typer embryonale celler. Som mange andre celletyper frigjør ESC-er små membran vesicles, for eksempel eksosomer, til det ekstracellulære miljøet. Eksosomer tjener som essensielle formidlere av intercellulær kommunikasjon og spiller en grunnleggende rolle i mange (pato)fysiologiske prosesser. Granulocytt-makrofag kolonistimulerende faktor (GM-CSF) fungerer som en cytokin for å modulere immunresponsen. Tilstedeværelsen av GM-CSF i eksosomer har potensial til å øke immunforsvaret. Her ble GM-CSF stabilt overekspressert i murine ESC-cellelinjen ES-D3. En protokoll ble utviklet for å isolere eksosole-berikede ekstracellulære vesikler av høy kvalitet (EVer) fra ES-D3-celler som overekspresserer GM-CSF. Isolerte eksosomberikede elbiler var preget av en rekke eksperimentelle tilnærminger. Det er viktig at betydelige mengder GM-CSF finnes i eksosomberikede elbiler. Totalt sett kan GM-CSF-bærende exosome-berikede EVer fra ESC-er fungere som cellefrie vesicles for å utøve sine immunregulerende aktiviteter.
Introduction
ESC er avledet fra blastocyststadiet av et preimplantasjonsembryo1. Som pluripotente stamceller har ESC evnen til å fornye seg selv og differensiere seg i alle typer embryonale celler. På grunn av deres bemerkelsesverdige utviklingspotensial og langsiktige proliferative kapasitet, er ESC-er ekstremt verdifulle for biomedisinsk forskning1. Nåværende forskningsinnsats har i stor grad fokusert på det terapeutiske potensialet til ESC for en rekke store patologiske lidelser, inkludert diabetes, hjertesykdom og nevrodegenerative sykdommer2,3,4.
Pattedyrceller, inkludert ESCer, er kjent for å frigjøre vesikler med variable størrelser til det ekstracellulære miljøet, og disse EVene har mange fysiologiske og patologiske funksjoner på grunn av deres rolle i intercellulær kommunikasjon5. Blant forskjellige undertyper av elbiler er eksosomer små membran vesicles frigjort fra ulike celletyper i det ekstracellulære rommet ved sammensmelting av mellomliggende endokytiske rom, multivesikulære legemer (MVB), med plasmamembranen6. Eksosomer har blitt rapportert å megle intercellulær kommunikasjon og er kritisk involvert i mange (pato)fysiologiske prosesser7,8. Eksosomer arver noen biologiske funksjoner fra sine egne foreldreceller, fordi eksosomer inneholder biologiske materialer anskaffet fra cytosolen, inkludert proteiner og nukleinsyrer. Dermed er de tilknyttede antigener eller faktorer som stimulerer immunresponsen som er spesifikk for en gitt sykdom, innkapslet i eksosomene fra bestemte typer celler9. Dette banet vei for kliniske studier som utforsket tumor-avledede eksosomer som en anti-kreftvaksine10.
GM-CSF er en cytokin utskilt av forskjellige typer immunceller11. Nye bevis viser at GM-CSF aktiverer og regulerer immunforsvaret og spiller en viktig rolle i antigen-presentasjonsprosessen12. For eksempel antyder en klinisk rapport at GM-CSF stimulerer immunresponsen på svulster som en vaksine adjuvant13. Flere GM-CSF-baserte kreftimmunoterapistrategier for å utnytte den potente immunstimulatoriske aktiviteten til GM-CSF har blitt undersøkt i kliniske studier14. Blant disse har en kreftvaksine sammensatt av bestrålede GM-CSF-utskillende tumorceller vist noe løfte hos avanserte melanompasienter ved å indusere cellulære og humorale antitumorresponser og påfølgende nekrose i metastaserte svulster15.
Fordi eksosomene avledet fra ESCs har lignende biologiske aktiviteter som de opprinnelige ESCene, kan kanskje GM-CSF-bærende eksosomer fra ESC-er fungere som cellefrie vesicles for å regulere immunresponsen. I dette dokumentet beskrives en detaljert metode for å produsere eksosomberikede elbiler av høy kvalitet fra ESC-er som uttrykker GM-CSF. Disse eksosomberikede ELBIL-ene har potensial til å fungere som immunregulerende vesikler for å modulere immunresponsen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne studien viser en svært effektiv metode for å produsere eksosomberikede elbiler som bærer immunstimulatorisk protein GM-CSF, som kan brukes til å studere immunmodulatoriske effekter av exosome-beriket EVs. Flere studier tyder på at eksosomer viser immunregulerende og anti-tumor funksjoner22. Dermed kan eksosomer fra ESC som uttrykker GM-CSF også ha biologiske aktiviteter som regulerer immunresponsen. I denne protokollen ble eksogen murin GM-CSF stabilt overekspressert i murine ES-D3-cel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er takknemlige til Mr. Arkadiusz Slusarczyk og Kentucky Biomedical Research Infrastructure Network (KBRIN, P20GM103436) for å skaffe overføringselektronmikroskopbilder. Dette arbeidet ble delvis støttet av tilskudd fra NIH AA018016-01 (J.W.E.), Commonwealth of Kentucky Research Challenge Trust Fund (J.W.E.), NIH CA106599 og CA175003 (C.L.), NIH CA198249 (K.Y.) og Free to Breathe Research Grant (K.Y.).
Materials
| Alkaline phosphate, Calf Intestinal | New England Biolabs | M0290S | Dephosphorylating DNA plasmid |
| anti-Annexin V mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone H-3, sc-74438 | Western blot, RRID:AB_1118989 |
| anti-CD81 mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone B-11, sc-166029 | Western blot, RRID:AB_2275892 |
| anti-cytochrome c mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone A-8, sc-13156 | Western blot, RRID:AB_627385 |
| anti-Flotillin-1 mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone C-2; sc-74566 | Western blot, RRID:AB_2106563 |
| anti-GAPDH pAb | Rockland | 600-401-A33S | Western blot, RRID:AB_11182910 |
| anti-mouse IgG, goat, peroxidase-conjugated | Thermo Fisher | 31430 | Western blot, RRID:AB_228307 |
| anti-Oxphos COX IV-subunit IV mAb | Thermo Fisher | clone 20E8C12 A21348 | Western blot, RRID:AB_221509 |
| anti-protein disulfide isomerase (PDI) pAb | Enzo | ADI-SPA-890 | Western blot, RRID:AB_10616242 |
| anti-rabbit IgG, goat, peroxidase-conjugated | Thermo Fisher | 31460 | Western blot, RRID:AB_228341 |
| BCA (bicinchoninic acid) assay | Thermo Fisher | 23223 | Determining protein concentrations |
| Bis-Tris PAGE Gel, ExpressPlus, 4-20% | Genscript | M42015 | Western blot |
| Carbenicillin, Disodium Salt | Thermo Fisher | 10177012 | Selecting E. coli colonies |
| Centrifuge, Avanti J-26 XPI | Beckman Coulter | Low speed centrifugation | |
| Centrifuge rotor, JA-10 | Beckman Coulter | 09U1597 | Low speed centrifugation |
| Centrifuge bottle, Nalgene PPCO | Thermo Fisher | 3120-0500PK | Low speed centrifugation |
| Cu grids with carbon support film | Electron Microscopy Sciences | FF200-Cu | Acquiring electron microscopy images |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101 | Digesting DNA plasmid |
| Enhanced chemiluminescence detection system | Thermo Fisher | 32106 | Western blot |
| FACScalibur flow cytometer | Becton Dickinson | Examining GFP levels of ES-D3 cells | |
| Fetal bovine serum | ATCC | SCRR-30-2020 | Medium for ES-D3 cells |
| Fisherbrand Sterile Cell Strainers; Mesh Size: 40μm | Thermo Fisher | 22-363-547 | Filtering ES-D3 cells for FACS sorting |
| Gelatin (0.1%) | Thermo Fisher | ES006B | Culturing ES-D3 cells |
| GM-CSF ELISA kit | Thermo Fisher | 88733422 | Determining GM-CSF concentrations |
| KnockOut Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Thermo Fisher | 10-829-018 | Medium for ES-D3 cells |
| Leukemia Inhibitory Factor | Thermo Fisher | ESG1106 | Medium for ES-D3 cells |
| L-glutamine | VWR | VWRL0131-0100 | Medium for ES-D3 cells |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher | 11668019 | Transfecting ES-D3 cells |
| Microplate reader, PowerWave XS | BioTek | Determining GM-CSF concentrations | |
| MoFlo XDP high-speed cell sorter | Beckman Coulter | Isolating single ES-D3 cell clones | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England Biolabs | C2988J | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Neomycin | Thermo Fisher | 10-131-035 | Selecting ES-D3 clones |
| Non-essential amino acids | Thermo Fisher | SH3023801 | Medium for ES-D3 cells |
| Non-fat dry milk | Thermo Fisher | NC9022655 | Western blot |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 | Transfecting ES-D3 cells |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Acquiring electron microscopy images |
| Penicillin/streptomycin | VWR | sc45000-652 | Medium for ES-D3 cells |
| Plasmid pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFP | Addgene | 37270 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| PVDF membranes | Millipore EMD | IPVH00010 | Western blot |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| QIAquick Gel Extraction Kit (50) | QIAGEN | 28704 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Quick Ligation Kit | New England Biolabs | M2200S | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Transmission electron microscope | Hitachi | HT7700 | Acquiring electron microscopy images |
| Trypsin | VWR | 45000-660 | Culturing ES-D3 cells |
| Ultracentrifuge, OptimaTM L-100 XP | Beckman Coulter | High speed centrifugation | |
| Ultracentrifuge rotor, 45Ti | Beckman Coulter | 09U4454 | High speed centrifugation |
| Ultracentrifuge polycarbonate bottle | Beckman Coulter | 355622 | High speed centrifugation |
| UranyLess staining solution | Electron Microscopy Sciences | 22409 | Acquiring electron microscopy images |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Sakthiswary, R., Raymond, A. A. Stem cell therapy in neurodegenerative diseases: From principles to practice. Neural Regeneration Research. 7 (23), 1822-1831 (2012).
- Liu, Y. W., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates. Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).
- Aguayo-Mazzucato, C., Bonner-Weir, S. Stem cell therapy for type 1 diabetes mellitus. Nature Reviews: Endocrinology. 6 (3), 139-148 (2010).
- Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Current Biology. 28 (8), R435-R444 (2018).
- Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles. Journal of Control Release. 244 (Pt B), 167-183 (2016).
- Lindenbergh, M. F. S., Stoorvogel, W. Antigen Presentation by Extracellular Vesicles from Professional Antigen-Presenting Cells. Annual Review of Immunology. 36, 435-459 (2018).
- Kunigelis, K. E., Graner, M. W. The Dichotomy of Tumor Exosomes (TEX) in Cancer Immunity: Is It All in the ConTEXt?. Vaccines (Basel). 3 (4), 1019-1051 (2015).
- Becher, B., Tugues, S., Greter, M. GM-CSF: From Growth Factor to Central Mediator of Tissue Inflammation. Immunity. 45 (5), 963-973 (2016).
- Conti, L., Gessani, S. GM-CSF in the generation of dendritic cells from human blood monocyte precursors: recent advances. Immunobiology. 213 (9-10), 859-870 (2008).
- Higano, C. S., et al. Integrated data from 2 randomized, double-blind, placebo-controlled, phase 3 trials of active cellular immunotherapy with sipuleucel-T in advanced prostate cancer. Cancer. 115 (16), 3670-3679 (2009).
- Yan, W. L., Shen, K. Y., Tien, C. Y., Chen, Y. A., Liu, S. J. Recent progress in GM-CSF-based cancer immunotherapy. Immunotherapy. 9 (4), 347-360 (2017).
- Dranoff, G., et al. Vaccination with irradiated tumor cells engineered to secrete murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor stimulates potent, specific, and long-lasting anti-tumor immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (8), 3539-3543 (1993).
- Tremml, G., Singer, M., Malavarca, R. Chapter 1, Unit 1C 4, Culture of mouse embryonic stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2008).
- Kirsch, P., Hafner, M., Zentgraf, H., Schilling, L. Time course of fluorescence intensity and protein expression in HeLa cells stably transfected with hrGFP. Molecules and Cells. 15 (3), 341-348 (2003).
- Zeng, X., et al. Stable expression of hrGFP by mouse embryonic stem cells: promoter activity in the undifferentiated state and during dopaminergic neural differentiation. Stem Cells. 21 (6), 647-653 (2003).
- Yaddanapudi, K., et al. Vaccination with embryonic stem cells protects against lung cancer: is a broad-spectrum prophylactic vaccine against cancer possible?. PLoS One. 7 (7), e42289 (2012).
- Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods. 33 (2), 95-103 (2004).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Chapter 3, Unit 3 22, Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , (2006).
- Zhang, X., et al. Exosomes for Immunoregulation and Therapeutic Intervention in Cancer. Journal of Cancer. 7 (9), 1081-1087 (2016).
- Bunggulawa, E. J., et al. Recent advancements in the use of exosomes as drug delivery systems. Journal of Nanobiotechnology. 16 (1), 81 (2018).
- Schlesinger, S., Lee, A. H., Wang, G. Z., Green, L., Goff, S. P. Proviral silencing in embryonic cells is regulated by Yin Yang 1. Cell Reports. 4 (1), 50-58 (2013).
- Dranoff, G. GM-CSF-based cancer vaccines. Immunological Reviews. 188, 147-154 (2002).
- Park, Y. G., et al. Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In Vitro. Development and Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).
- Lin, S., Talbot, P. Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells. Methods in Molecular Biology. 690, 31-56 (2011).
- Yaddanapudi, K., et al. Exosomes from GM-CSF expressing embryonic stem cells are an effective prophylactic vaccine for cancer prevention. OncoImmunology. 8 (3), 1561119 (2019).
