امتصاص الحويصلات الهجينة العملاقة أحاديه الجانب بالكهرباء وقياس خواصها الميكانيكية من خلال شفط الماصات المجهرية
Summary
والهدف من البروتوكول هو قياس الخواص الميكانيكية الغشائية للحويصلات العملاقة بشكل موثوق من خلال شفط الماصة المجهرية.
Abstract
ويمكن استغلال الحويصلات العملاقة التي يتم الحصول عليها من الدهون الفوسفاتية والبوليمرات في تطبيقات مختلفه: تسليم المخدرات الخاضعة للرقابة والمستهدفة ، والاعتراف بالجزيئات الحيوية في التشخيص ، والاغشيه الوظيفية للخلايا الاصطناعية ، وتطوير مفاعلات مجهريه/نانو. في جميع هذه التطبيقات ، وتوصيف خصائص غشاء لها اهميه أساسيه. ومن بين تقنيات التوصيف الحالية ، فان طموح الماصة المجهرية ، الذي كان رائدا من قبل e. ايفانز ، يسمح بقياس الخواص الميكانيكية لغشاء مثل معامل انضغاط المنطقة ، ومعامل الانحناء ، والإجهاد تحلل والسلالة. هنا ، نقدم جميع المنهجيات والإجراءات التفصيلية للحصول علي حويصلات عملاقه من الغشاء الرقيق للدهون أو البوليمرات (أو كليهما) ، والتصنيع والمعالجة السطحية من الماصات الدقيقة ، والاجراء الطموح الذي يؤدي إلى قياس جميع المعلمات المذكورة سابقا.
Introduction
الحويصلات العملاقة التي تم الحصول عليها من الدهون الفوسفاتية (الدهنية) وقد استخدمت علي نطاق واسع منذ 1970s كنموذج غشاء الخلية الاساسيه1. في أواخر 1990s ، التي تم الحصول عليها من التجميع الذاتي من البوليمرات النحاسية ، اسمه بوليميرسوميس في اشاره إلى نظيره الدهون2،3، ظهرت بسرعة كبديل مثيره للاهتمام للدهنيات التي تمتلك الاستقرار الميكانيكية ضعيفه والفقراء وظائف الكيميائية وحدات. ومع ذلك ، فان الطابع الحيوي للخلية الخاصة بهم محدوده بالمقارنة مع الجسيمات الشحمية لان الاخيره تتكون من الدهون الفوسفاتية ، المكون الرئيسي لغشاء الخلية. وعلاوة علي ذلك ، فان نفاذيه غشاء منخفضه يمكن ان يكون مشكله في بعض التطبيقات مثل تسليم المخدرات حيث الانتشار الخاضع للرقابة من الأنواع من خلال الغشاء مطلوب. في الاونه الاخيره ، كانت جمعيه الفوسفورية مع كتله البوليمرات لتصميم الهجينة البوليمر الدهون الحويصلات والاغشيه موضوعا لعدد متزايد من الدراسات4،5. الفكرة الرئيسية هي لتصميم الكيانات التي تازر الجمع بين فوائد كل مكون (الوظائف الحيوية ونفاذيه الطبقات الدهنية مع الاستقرار الميكانيكي وبراعة الكيميائية من اغشيه البوليمر) ، والتي يمكن استغلالها في تطبيقات مختلفه: تسليم المخدرات الخاضعة للرقابة والمستهدفة ، والتعرف علي الجزيئات الحيوية داخل الخلايا البيولوجية للتشخيص ، والاغشيه الوظيفية للخلايا الاصطناعية ، وتطوير المجهرية مستوحاه من بيو-/نانوسوتوريس.
في الأيام الحالية ، المجتمعات العلمية المختلفة (الكيمياء الحيوية ، الكيميائيين ، الصيدلة البيولوجية ، الفيزيائية الكيميائية ، علماء الاحياء) لديها اهتمام متزايد في تطوير نموذج غشاء الخلية أكثر تقدما. هنا ، هدفنا هو تقديم ، علي النحو المفصل بقدر الإمكان ، المنهجيات الموجودة (الكهرباء ، شفط الماصات الدقيقة) للحصول علي وتوصيف الخواص الميكانيكية للحويصلات العملاقة ونماذج غشاء الخلية “المتقدمة” الاخيره التي هي الهجين البوليمر الدهون العملاقة حويصلات4
والغرض من هذه الأساليب هو الحصول علي قياس موثوق بها للضغط المنطقة والانحناء بلتيير من الغشاء ، فضلا عن الإجهاد تحلل وسلاله. واحده من التقنيات الأكثر شيوعا الموجودة لقياس صلابة الانحناء من حويصلة عملاقه هو تذبذب تحليل6،7، استنادا إلى مراقبه المجهر الفيديو المباشر ؛ ولكن هذا يتطلب تذبذبا كبيرا في الغشاء المرئي ، ولا يتم الحصول عليه بشكل منتظم علي الاغشيه السميكة (مثل بوليميرسوميس). يمكن تحديد معامل الانضغاط المنطقة بالتجربة باستخدام تقنيه لانموير بلودغيت ولكن في معظم الأحيان علي أحادي الطبقة8. تسمح تقنيه شفط الماصات المجهرية بقياس كل من التحوير علي طبقه ثنائيه تشكل الحويصلة الاحاديه العملاقة (GUV) في تجربه واحده.
الطريقة التالية مناسبه لجميع الجزيئات البرمائية أو الجزيئات قادره علي تشكيل الطبقات الثنائية ، التالي ، حويصلات بالكهرباء. وهذا يتطلب طابعا سائلا من الطبقة الثنائية عند درجه حرارة الكهرباء.
Protocol
Representative Results
Discussion
ان طلاء الماصات المجهرية هو أحد النقاط الرئيسية للحصول علي قياسات موثوقه. يجب منع التصاق الحويصلة بالماصة ، ويشيع استخدام الطلاء في الأدب17،18،19،20،21، مع جيش صرب الجمهورية ، β-الكازين أو surfasil. ونادرا م?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويعرب المؤلفون عن امتنانهم للمخابرات الخاصة بالدعم المالي (ANR Sysa).
Materials
| Required equipment and materials for micropipette design | |||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | external and internal diameter of 1mm and 0.58 mm respectively. |
| Filament installed | Sutter Instrument Co. | FB255B | 2.5mm*2.5mm Box Filament |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | |
| Microforge | NARISHGE Co. | MF-900 | fitted with two objectives (10x and 32x) |
| Materials for coating pipette tips with BSA | |||
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Sigma-Aldrich | 10735078001 | |
| Disposable 1 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.1612 | |
| Disposable 10 ml syringe Luer Tip | Codan | 626616 | |
| Disposable 5 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.5607 | |
| Disposable acetate cellulose filter | Cluzeau Info Labo | L5003SPA | Pore size: 0.22µm, diameter: 25mm |
| Flexible Fused Silica Capillary Tubing | Polymicro Technologies. | TSP530660 | Inner Diameter 536µm, Outer Diameter 660µm, |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Syringe 500 µL luer Lock GASTIGHT | Hamilton Syringe Company | 1750 | |
| Test tube rotatory mixer | Labinco | 28210109 | |
| Micromanipulation Set up | |||
| Aluminum Optical Rail, 1000 mm Length, M4 threads, X48 Series | Newport | ||
| Damped Optical Table | Newport | used as support of microscope to prevent external vibrations. | |
| Micromanipulator | Eppendorf | Patchman NP 2 | The module unit (motor unit for X, Y and Z movement) is mounted on the inverted microscope by the way of an adapter. |
| Micrometer | Mitutoyo Corporation | 350-354-10 | Digimatic LCD Micrometer Head 25,4 mm Range 0,001 mm |
| Plexiglass water reservoir (100 ml) | Home made | ||
| TCS SP5 inverted confocal microscope (DMI6000) equipped with a resonant scanner and a water immersion objective (HCX APO L 40x/0.80 WU-V-I). | Leica | ||
| X48 Rail Carrier 80 mm Length,with 1/4-20, 8-32 and 4-40 thread | Newport | ||
| Materials for sucrose and amphiphile solution preparation | |||
| 2-Oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Sigma-Aldrich | ||
| Chloroform | VWR | 22711.244 | |
| L-α-Phosphatidylethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) | Sigma-Aldrich | 810146C | Rhodamine tagged lipid |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Electroformation set up | |||
| 10 µL glass capillary ringcaps | Hirschmann | 9600110 | |
| Disposable 1 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.1612 | |
| H Grease | Apiezon | Apiezon H Grease | Silicon-free grease |
| Indium tin oxide coated glass slides | Sigma-Aldrich | 703184 | |
| Needle | Terumo | AN2138R1 | 0.8 x 38 mm |
| Ohmmeter (Multimeter) | Voltcraft | VC140 | |
| Toluene | VWR | 28676.297 | |
| Voltage generator | Keysight | 33210A |
Riferimenti
- Bangham, A. D., Standish, M. M., Watkins, J. C. Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids. Journal of Molecular Biology. 13 (1), (1965).
- Discher, D. E., Eisenberg, A. Polymer vesicles. Science. 297 (5583), 967-973 (2002).
- Hammer, D., et al. Polymersomes: vesicles from block copolymers. Annals of Biomedical Engineering. 28 (SUPPL. 1), (2000).
- Le Meins, J. F., Schatz, C., Lecommandoux, S., Sandre, O. Hybrid polymer/lipid vesicles: state of the art and future perspectives. Materials Today. 16 (10), 397-402 (2013).
- Schulz, M., Binder, W. H. Mixed Hybrid Lipid/Polymer Vesicles as a Novel Membrane Platform. Macromolecular Rapid Communications. 36, 2031-2041 (2015).
- Schneider, M. B., Jenkins, J. T., Webb, W. W. Thermal fluctuations of large quasi-spherical bimolecular phospholipid vesicles. Journal De Physique. 45 (9), 1457-1472 (1984).
- Dimova, R. Recent developments in the field of bending rigidity measurements on membranes. Advances in Colloid and Interface Science. 208, 225-234 (2014).
- Rodríguez-García, R., et al. Polymersomes: smart vesicles of tunable rigidity and permeability. Soft Matter. 7 (4), 1532-1542 (2011).
- Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).
- Dao, T. P. T., et al. Membrane properties of giant polymer and lipid vesicles obtained by electroformation and pva gel-assisted hydration methods. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 533, 347-353 (2017).
- Pereno, V., et al. Electroformation of Giant Unilamellar Vesicles on Stainless Steel Electrodes. ACS omega. 2 (3), 994-1002 (2017).
- Evans, E., Rawicz, W. Entropy-driven tension and bending elasticity in condensed-fluid membranes. Physical Review Letters. 64 (17), 2094-2097 (1990).
- Dao, T. P. T., et al. Modulation of phase separation at the micron scale and nanoscale in giant polymer/lipid hybrid unilamellar vesicles (GHUVs). Soft Matter. 13 (3), 627-637 (2017).
- Helfrich, W. Elastic properties of lipid bilayers: theory and possible experiments. Z Naturforsch C. 11 (11), 693-703 (1973).
- Dao, T. P. T., et al. The combination of block copolymers and phospholipids to form giant hybrid unilamellar vesicles (GHUVs) does not systematically lead to "intermediate” membrane properties. Soft Matter. 14 (31), 6476-6484 (2018).
- Shoemaker, S. D., Kyle Vanderlick, T. Material Studies of Lipid Vesicles in the Lα and Lα-Gel Coexistence Regimes. Biophysical Journal. 84 (2), 998-1009 (2003).
- Longo, M. L., Ly, H. V., Dopico, A. M. . Methods in Membrane Lipids. , 421-437 (2007).
- Chen, D., Santore, M. M. Hybrid copolymer-phospholipid vesicles: phase separation resembling mixed phospholipid lamellae, but with mechanical stability and control. Soft Matter. 11 (13), 2617-2626 (2015).
- Mabrouk, E., et al. Formation and material properties of giant liquid crystal polymersomes. Soft Matter. 5, 1870-1878 (2009).
- Henriksen, J., et al. Universal behavior of membranes with sterols. Biophysical Journal. 90 (5), 1639-1649 (2006).
- Ly, H. V., Block, D. E., Longo, M. L. Interfacial Tension Effect of Ethanol on Lipid Bilayer Rigidity, Stability, and Area/Molecule: A Micropipet Aspiration Approach. Langmuir. 18 (23), 8988-8995 (2002).
- Bermudez, H., Hammer, D. A., Discher, D. E. Effect of Bilayer Thickness on Membrane Bending Rigidity. Langmuir. 20, 540-543 (2004).
