Obtention של ענק Unilamellar היברידית ושלפוחיות על ידי אלקטרוונטור ומדידה של תכונות מכניות שלהם על ידי שאיפה מיקרופיפטה
Summary
מטרת הפרוטוקול היא למדוד באופן אמין תכונות מכניות של ממברנה של שלפוחיות ענק על ידי שאיפה מיקרופיפטה.
Abstract
שלפוחיות ענק שהתקבלו מפוספוליפידים וסופולימרים יכולים להיות מנוצלים ביישומים שונים: מסירה מבוקרת וממוקדת של תרופות, זיהוי ביולוגי בתוך הביו-חיישנים לאבחון, ממברנות פונקציונליים לתאים מלאכותיים, ופיתוח של ביו-כורים מיקרו/ננו-בהשראת. בכל היישומים הללו, האפיון של תכונות הממברנה שלהם הוא בעל חשיבות בסיסית. בין טכניקות האפיון הקיימות, שאיפה של מיקרופיפטה, חלוץ על ידי ה-אוונס, מאפשר את המדידה של תכונות מכניות של הממברנה כגון מודול האזור, כיפוף מודול הלחץ ומתח. כאן, אנו מציגים את כל המתודולוגיות והליכים מפורטים כדי להשיג שלפוחיות ענק מתוך הסרט הדק של השומנים או קופולימר (או שניהם), הייצור ועל פני השטח של מיקרופיפטות, ואת ההליך שאיפה המוביל למדידה של כל הפרמטרים שהוזכרו קודם לכן.
Introduction
שלפוחיות ענק שהתקבלו מ פוספוליפידים (ליפוזומים) כבר בשימוש נרחב מאז שנות ה-70 כמו קרום התא הבסיסי מודל1. בסוף שנות ה-90, מורפולוגיות ומורסיידים שהתקבלו מהרכבה עצמית של סופולימרים, ששמו פולימזומים בהתייחס לאנלוגיות השומנים שלהם2,3, הופיע במהירות כחלופה מעניינת ליפוזומים בעלי יציבות מכנית חלשה ופונקציונליות כימית מודולרית מודולרי. עם זאת, הדמות התאית שלהם הוא מוגבל למדי לעומת ליפוזומים מאז האחרון מורכב פוספוליפידים, המרכיב העיקרי של קרום התא. יתר על כן, חדירות הממברנה הנמוכות שלהם יכול להיות בעיה בכמה יישומים כמו משלוח סמים שבו הפצת מבוקרת של מינים באמצעות קרום נדרש. לאחרונה, האגודה של פוספוליפידים עם בלוק סופולימרים לעצב היברידית פולימר-ליפיד ושלפוחיות וממברנות כבר הנושא של מספר גדל והולך של לימודים4,5. הרעיון המרכזי הוא לעצב ישויות שלשלב את היתרונות של כל רכיב (ביו-פונקציונליות וחדירות של bilayers השומנים עם היציבות המכנית ורב-תכליתיות כימית של ממברנות פולימר), אשר ניתן לנצל ביישומים שונים: מבוקר וממוקד התרופה מסירה, זיהוי ביולוגי בתוך ביוחיישנים לאבחון, ממברנות פונקציונלי עבור תאים מלאכותיים, פיתוח של ביו בהשראת מיקרו/ננו-soa.
כיום, קהילות מדעיות שונות (ביו-כימאים, כימאים, ביוסיסטים, פיזיקאלית-כימאים, ביולוגים) יש עניין הולך וגובר בפיתוח של מודל קרום התא מתקדם יותר. כאן, המטרה שלנו היא להציג, כפי שניתן מפורט ככל האפשר, הקיימות מתודולוגיות (אלקטרופיטיות, שאיפה מיקרופיפטה) כדי להשיג ולאפיין את התכונות המכאניות של שלפוחיות ענק והאחרונה “מתקדמים” ממברנה קרום התא מודלים היברידי פולימר שומנים ענק שלפוחיות4,5.
המטרה של שיטות אלה היא להשיג מדידה אמינה של האזור בכיפוף וכיפוף מודולים של קרום, כמו גם מתח הפירוק שלהם ואת המתח. אחת הטכניקות הנפוצות ביותר למדוד קשיחות כיפוף של שלפוחית שלפוחית ענק הוא ניתוח תנודות6,7, מבוסס על מיקרוסקופ וידאו ישיר תצפית; אבל זה דורש תנודות גדולות בקרום הממברנה, והוא לא מתקבל באופן שיטתי על קרומים עבים (למשל פלזומים). מודול השטח ניתן לניסויים בשיטת לאנגיור בלופ, אך לרוב על מונאולייר8. טכניקת השאיפה של המיקרופיפטה מאפשרת את המדידה של שני המודולקים על ידי היווצרות unilamellar שלפוחית לפוחית ענק (בוס) בניסוי אחד.
השיטה הבאה מתאימה לכל המולקולות האמפיפיטיות או קרו מסוגלות ליצור בילאיירס וכתוצאה מכך, שלפוחיות על ידי מערך אלקטרוריות. זה דורש אופי נוזלי של הביאייר בטמפרטורה של היווצרות החשמל.
Protocol
Representative Results
Discussion
ציפוי המיקרופיפטה הוא אחת הנקודות המרכזיות להשגת מדידות אמינות. יש למנוע הדבקה של שלפוחית המנוע למיקרו-פיפטה, וציפוי משמש לרוב בספרות17,18,19,20,21, עם bsa, β-קזאין או סורפסיל. פרטים על תהליך הציפוי מוזכרים ל…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מכירים בהכרת תודה את ה-ANR לקבלת תמיכה כספית (ANR Sysa).
Materials
| Required equipment and materials for micropipette design | |||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | external and internal diameter of 1mm and 0.58 mm respectively. |
| Filament installed | Sutter Instrument Co. | FB255B | 2.5mm*2.5mm Box Filament |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | |
| Microforge | NARISHGE Co. | MF-900 | fitted with two objectives (10x and 32x) |
| Materials for coating pipette tips with BSA | |||
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Sigma-Aldrich | 10735078001 | |
| Disposable 1 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.1612 | |
| Disposable 10 ml syringe Luer Tip | Codan | 626616 | |
| Disposable 5 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.5607 | |
| Disposable acetate cellulose filter | Cluzeau Info Labo | L5003SPA | Pore size: 0.22µm, diameter: 25mm |
| Flexible Fused Silica Capillary Tubing | Polymicro Technologies. | TSP530660 | Inner Diameter 536µm, Outer Diameter 660µm, |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Syringe 500 µL luer Lock GASTIGHT | Hamilton Syringe Company | 1750 | |
| Test tube rotatory mixer | Labinco | 28210109 | |
| Micromanipulation Set up | |||
| Aluminum Optical Rail, 1000 mm Length, M4 threads, X48 Series | Newport | ||
| Damped Optical Table | Newport | used as support of microscope to prevent external vibrations. | |
| Micromanipulator | Eppendorf | Patchman NP 2 | The module unit (motor unit for X, Y and Z movement) is mounted on the inverted microscope by the way of an adapter. |
| Micrometer | Mitutoyo Corporation | 350-354-10 | Digimatic LCD Micrometer Head 25,4 mm Range 0,001 mm |
| Plexiglass water reservoir (100 ml) | Home made | ||
| TCS SP5 inverted confocal microscope (DMI6000) equipped with a resonant scanner and a water immersion objective (HCX APO L 40x/0.80 WU-V-I). | Leica | ||
| X48 Rail Carrier 80 mm Length,with 1/4-20, 8-32 and 4-40 thread | Newport | ||
| Materials for sucrose and amphiphile solution preparation | |||
| 2-Oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Sigma-Aldrich | ||
| Chloroform | VWR | 22711.244 | |
| L-α-Phosphatidylethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) | Sigma-Aldrich | 810146C | Rhodamine tagged lipid |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Electroformation set up | |||
| 10 µL glass capillary ringcaps | Hirschmann | 9600110 | |
| Disposable 1 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.1612 | |
| H Grease | Apiezon | Apiezon H Grease | Silicon-free grease |
| Indium tin oxide coated glass slides | Sigma-Aldrich | 703184 | |
| Needle | Terumo | AN2138R1 | 0.8 x 38 mm |
| Ohmmeter (Multimeter) | Voltcraft | VC140 | |
| Toluene | VWR | 28676.297 | |
| Voltage generator | Keysight | 33210A |
Riferimenti
- Bangham, A. D., Standish, M. M., Watkins, J. C. Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids. Journal of Molecular Biology. 13 (1), (1965).
- Discher, D. E., Eisenberg, A. Polymer vesicles. Science. 297 (5583), 967-973 (2002).
- Hammer, D., et al. Polymersomes: vesicles from block copolymers. Annals of Biomedical Engineering. 28 (SUPPL. 1), (2000).
- Le Meins, J. F., Schatz, C., Lecommandoux, S., Sandre, O. Hybrid polymer/lipid vesicles: state of the art and future perspectives. Materials Today. 16 (10), 397-402 (2013).
- Schulz, M., Binder, W. H. Mixed Hybrid Lipid/Polymer Vesicles as a Novel Membrane Platform. Macromolecular Rapid Communications. 36, 2031-2041 (2015).
- Schneider, M. B., Jenkins, J. T., Webb, W. W. Thermal fluctuations of large quasi-spherical bimolecular phospholipid vesicles. Journal De Physique. 45 (9), 1457-1472 (1984).
- Dimova, R. Recent developments in the field of bending rigidity measurements on membranes. Advances in Colloid and Interface Science. 208, 225-234 (2014).
- Rodríguez-García, R., et al. Polymersomes: smart vesicles of tunable rigidity and permeability. Soft Matter. 7 (4), 1532-1542 (2011).
- Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).
- Dao, T. P. T., et al. Membrane properties of giant polymer and lipid vesicles obtained by electroformation and pva gel-assisted hydration methods. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 533, 347-353 (2017).
- Pereno, V., et al. Electroformation of Giant Unilamellar Vesicles on Stainless Steel Electrodes. ACS omega. 2 (3), 994-1002 (2017).
- Evans, E., Rawicz, W. Entropy-driven tension and bending elasticity in condensed-fluid membranes. Physical Review Letters. 64 (17), 2094-2097 (1990).
- Dao, T. P. T., et al. Modulation of phase separation at the micron scale and nanoscale in giant polymer/lipid hybrid unilamellar vesicles (GHUVs). Soft Matter. 13 (3), 627-637 (2017).
- Helfrich, W. Elastic properties of lipid bilayers: theory and possible experiments. Z Naturforsch C. 11 (11), 693-703 (1973).
- Dao, T. P. T., et al. The combination of block copolymers and phospholipids to form giant hybrid unilamellar vesicles (GHUVs) does not systematically lead to "intermediate” membrane properties. Soft Matter. 14 (31), 6476-6484 (2018).
- Shoemaker, S. D., Kyle Vanderlick, T. Material Studies of Lipid Vesicles in the Lα and Lα-Gel Coexistence Regimes. Biophysical Journal. 84 (2), 998-1009 (2003).
- Longo, M. L., Ly, H. V., Dopico, A. M. . Methods in Membrane Lipids. , 421-437 (2007).
- Chen, D., Santore, M. M. Hybrid copolymer-phospholipid vesicles: phase separation resembling mixed phospholipid lamellae, but with mechanical stability and control. Soft Matter. 11 (13), 2617-2626 (2015).
- Mabrouk, E., et al. Formation and material properties of giant liquid crystal polymersomes. Soft Matter. 5, 1870-1878 (2009).
- Henriksen, J., et al. Universal behavior of membranes with sterols. Biophysical Journal. 90 (5), 1639-1649 (2006).
- Ly, H. V., Block, D. E., Longo, M. L. Interfacial Tension Effect of Ethanol on Lipid Bilayer Rigidity, Stability, and Area/Molecule: A Micropipet Aspiration Approach. Langmuir. 18 (23), 8988-8995 (2002).
- Bermudez, H., Hammer, D. A., Discher, D. E. Effect of Bilayer Thickness on Membrane Bending Rigidity. Langmuir. 20, 540-543 (2004).
