הדמיה הזמן 2D דימות של פעילות Phagocytic ב-M1 מקרופאג-4T1 עכבר קרצינומה של החלב תאים במשותף תרבויות
Summary
פעילות מקרופאג phagocytic נגד תאים סרטניים, במיוחד 4T1 עכבר קרצינומה של החלב בתאי, היה בתמונה במחקר זה. מודל התרבות של התאים החיים הוקם ונצפה בשילוב של מיקרוסקופ פלורסנט והפרעות דיפרנציאליות. הערכה זו היתה תמונה באמצעות תוכנת דימות כדי לפתח וידאו לפקיעה מרובה נקודות.
Abstract
מקרופאגים הקשורים לגידול (TAMs) זוהו כמרכיב חשוב לצמיחה הגידול, פלישה, גרורות, והתנגדות לטיפולים בסרטן. עם זאת, מקרופאגים הקשורים לגידול יכול להזיק לגידול בהתאם מיקרו הסביבה הגידול יכול להיות הפיך לשנות את מאפייני פנוטימית שלהם על ידי שינוי הפעילות הציטוטוקסיים של תאים חיסוניים או שיפור התגובה נגד הגידול. הפעולות המולקולריות של מקרופאגים והאינטראקציות שלהם עם תאי גידול (למשל, phagocytosis) לא נחקרו בהרחבה. לכן, את האינטראקציה בין התאים החיסוניים (M1/M2-תת-תחום טאם) ואת התאים הסרטניים מיקרוסביבה הגידול הוא כעת מוקד של מחקר חיסוני סרטן. במחקר הנוכחי, תא חי מודל התרבות של מקרופאגים המושרה M1 ו הפטמות העכבר 4T1 תאים קרצינומה פותחה כדי להעריך את הפעילות phagocytic של מקרופאגים באמצעות תכונת וידאו בזמן הקפיצה באמצעות שלב-ניגודיות, פלורסנט, ו הפרעות הפרעה ההפרש (DIC) מיקרוסקופ. השיטה הנוכחית יכולה להתבונן ולתעד הדמיה של תא חי רב-נקודות של phagocyציטוזה. פאיגוציטוזה של התאים 4T1 על-ידי מקרופאגים M1 ניתן לצפות באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט לפני צביעת התאים 4T1 עם carboxyפלואורומיתעין (CFSE). הפרסום הנוכחי מתאר כיצד להתאים מקרופאגים ותאי הגידול בצלחת הדמיה אחת, הקיטוב מקרופאגים M1, ולהקליט אירועים נקודתי של מקרופאגים בשחוד 4t1 תאים במהלך 13 h של התרבות הקובית.
Introduction
מקרופאגים הם השורה הראשונה של הגנה חיסונית לשחק תפקיד מנצח את התגובות החיסונית נגד פתוגנים וחומרים זרים, כולל תאים סרטניים. הם פגוציט מיוחדים ההורס ומקבל להיפטר חלקיקים לא רצויים בגוף. מקרופאגים לתרום פונקציות הגנתי כגון הסיווג של תאים אפוטוטיים ומיקרואורגניזמים וגיוס של תאים חיסוניים אחרים1. מקרופאגים יכולים להבדיל לשני סוגים שונים, M1 ו M2 מקרופאגים, בתגובה לאותות סביבתיים2. M1-מקרופאגים (כלומר, מקרופאגים המופעל באופן קלאסי) מופעלים על ידי ציטוקינים אינטרפרון-γ (ifn-γ) וליפופוליסכולידים (lps) והם מעורבים בתגובה דלקתית, מחלת הפתוגן, החיסון היעיל phagocyציטוזה, ו-tumoricidal חסינות3,4. מקרופאגים M2 הם קשורים הדוק מקרופאגים הקשורים לגידול (TAMs) ויש להם אנטי דלקתיות ומאפיינים קידום הגידול4.
פאיגוציטוזה, נגזר מיוונית עתיקה (phaחיין), כלומר “לטרוף,” (kytos), כלומר “תא” ו-osis, כלומר “תהליך”5. Phagocyציטוזה הוא תהליך קולטן בתיווך שבו phagocytes (כולל מקרופאגים, מונוציטים, ו נויטרופילים) להרוג ו בלוע הפולשים פתוגנים, לנקות חלקיקים זרים, ושרידים ברורים תאים האפוטוטיים. הגידול משויך מקרופאגים (tams) נמצאים הסטרומה בגידולים שונים, כולל סרטן השד, יש פונקציות pro-הגידול6,7, וכתוצאה מכך התנגדות phagocyציטוזה. המנגנון המפורט של תאי הגידול phagocyציטוזה על ידי מקרופאגים אינו מובן עדיין.
מחקר זה מציג שיטת שני שלבים: 1) 4T1 עכבר קרצינומה של הפטמות מקוטב M1 ומקרופאגים מקוטנים של מקרופאגים, ו 2) הפעילות phagocytic של המקרופאגים מוערך באמצעות מיקרוסקופ וידאו של תא חי. צבען פלורסנט CFSE שימש כדי להכתים את התאים 4T1 החלב קרצינומה של הפטמות. הכתם תוויות 4T1 תאים כדי להבדיל ביניהם מקרופאגים של M1 מתורבת בתוך צלחת הדמיה אחת. RAW 264.7 מקרופאגים הם מקוטב עם LPS ו IFN-γ לתוך הפנוטיפים M1. כדי להבטיח פולריזציה מלאה, הכתים עם נוגדן anti-iNOS מצותמים ל-FITC בוצעה. לאחר מכן, סדרה מרובת נקודות של תמונות מעידה בזמן נרכשה כדי להתבונן באירועים מרובים, כולל phagocyציטוזה, בתוך התרבות הקובית.
הבנה טובה יותר של האינטראקציות בין תאים סרטניים מקרופאגים עלול לגרום לטיפול חיסוני פוטנציאלי בסרטן. הדמיה של תא חי מציעה תצוגה מפורטת של דינמיקה סלולרית בהגדרה בזמן אמת, שימש לחקר הגירה של תאים, הקרנה פנוטימית, אפופטוזיס, ו-ציטורעילות8,9 ב מדעי המוח, ביולוגיה התפתחותית, וגילוי סמים. למרות הגידול המוצע במחקר זה הוא סרטן השד, השיטה יכולה גם להיות מוחל על מספר תאים היעד ואת התאים הנפרדים אפקטור.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר דורש שני שלבים: 1) התרבות הcoculture של 4T1 תאים קרצינומה של החלב של העכבר ו-M1 מקוטב, ו 2) הערכה של פעילות מקרופאג phagocytic באמצעות מיקרוסקופ זמן לשגות. התרבות התאית לחיות היא בשימוש נרחב phagocyציטוזה הגירה assays. מודל התרבות של התאים החיים כאן הוא פשוט, הליך מחוץ ליכולת הסתגלות (<strong class="xfi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו הייתה ממומנת כלכלית על ידי Geran Putra Berimpak (GBP), אוניברסיטי פוטרה מלזיה: 9542800. אנחנו רוצים להודות למעבדות אגרו-ביוטכנולוגיה, מלזיה (ABI) מעבדות, ומתקן הדמיה מיקרוסקופית. תודות מיוחדות לוהד דניאל עזים לקבלת עזרה בעריכה והקלטה של הסרטון הניסיוני לעבודה זו.
Materials
| Anti-INOS antibody conjugated FITC | Miltenyi Biotec | REA982 | 150 µg in 1 mL |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Invitrogen | C1157 | 25 mg |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | 10 mg |
| DMEM/high glucose | HyClone | SH30003.04 | 670.0 g |
| Fetal bovine serum | Tico Europe | FBSEU500 | 500 mL |
| Lipopolysaccharides | Sigma | L4516-1MG | 1 mg |
| Mouse recombinant interferon-gamma | Stemcell Technologies | 78021 | 100 µg |
| Penicillin-streptomycin solution | Cellgro | 30-003-CI | 100 mL |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | 10 pack |
| Trypsin EDTA | Cellgro | 25-052-CI | 1X, 100 mL |
| 1000 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-01-052 | 5000 tips/case |
| 2 mL serological pipette | JET BIOFIL | GSP012002 | Non-pryogenic |
| 200 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-02-302 | 20,000 tps/case |
| 25 cm2 cell culture flask | Corning | CLS430639 | Tissue culture treated |
| Bench top centrifuge | Dynamica | FA15C | Model: Velocity 14R |
| Biological safety fume hood | Nuaire | NU-565-400 | Model: Home/ LabGard® ES TE NU-565 Class II, Type B2 Biosafety Fume Hood |
| CO2/air mixer | Chamlide (Live Cell Instrument) | FC-R-20 | FC-5 (CO2/Air Mixer) with the flow meter |
| Cell scrapper | NEST | 710001 | 220 mm |
| CO2 cell incubator | Panasonic | N/A | Model: MCO-19M(UV) |
| Confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Ti-Eclipse |
| Glass bottom dish | Ibidi | 81218-200 | 35 mm |
| NIS elements software | Nikon Instruments Inc. | Available online download | |
| Pipette controller | CappAid | PA-100 | CappController pipette controller, 0.1-100ml |
| Thermostat | Shinko | Discontinued | JCS-33A 48 x 48 x 96.5mm |
Riferimenti
- Rostam, H. M., Reynolds, P. M., Alexander, M. R., Gadegaard, N., Ghaemmaghami, A. M. Image based Machine Learning for identification of macrophage subsets. Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).
- Mantovani, A., Sozzani, S., Locati, M., Allavena, P., Sica, A. Macrophage polarization: Tumor-associated macrophages as a paradigm for polarized M2 mononuclear phagocytes. Trends in Immunology. , (2002).
- Lee, K. Y. . M1 and M2 polarization of macrophages a mini-review. 2 (1), 1-5 (2019).
- Martinez-Marin, D., Jarvis, C., Nelius, T., Filleur, S. Assessment of phagocytic activity in live macrophages-tumor cells cocultures by Confocal and Nomarski Microscopy. Biology Methods and Protocols. 2 (1), 1-7 (2017).
- Tauber, A. I. Metchnikoff and the phagocytosis theory. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (11), 897-901 (2003).
- Eiro, N., Gonzalez, L. O., Cid, S., Schneider, J., Vizoso, F. J. Breast Cancer Tumor Stroma: Cellular Components, Phenotypic Heterogeneity, Intercellular Communication, Prognostic ImplicationsTherapeutic Opportunities. Cancers. 11 (5), 1-26 (2019).
- Larionova, I., et al. Interaction of tumor-associated macrophages and cancer chemotherapy. OncoImmunology. 8 (7), 1-15 (2019).
- Jain, P., Worthylake, R. A., Alahari, S. K. Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (63), e3585 (2012).
- Weiss, S., Luchman, H. A., Restall, I., Bozek, D. A., Chesnelong, C. Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion. Journal of Visualized Experiments. (138), e58152 (2018).
- Tsitsilashvili, E., Sepashvili, M., Chikviladze, M., Shanshiashvili, L., Mikeladze, D. Myelin basic protein charge isomers change macrophage polarization. Journal of Inflammation Research. 12, 25-33 (2019).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).
- Kobelt, G., Eriksson, J., Phillips, G., Berg, J. The burden of multiple sclerosis 2015: Methods of data collection, assessment and analysis of costs, quality of life and symptoms. Multiple Sclerosis Journal. 2, 153-156 (2017).
- Escórcio-Correia, M., Hagemann, T. Measurement of tumor cytolysis by macrophages. Current Protocols in Immunology. , 1-11 (2011).
- Cui, K., Ardell, C. L., Podolnikova, N. P., Yakubenko, V. P. Distinct migratory properties of M1, M2, and resident macrophages are regulated by αdβ2and αmβ2integrin-mediated adhesion. Frontiers in Immunology. 9, 1-14 (2018).
- McWhorter, F. Y., Wang, T., Nguyen, P., Chung, T., Liu, W. F. Modulation of macrophage phenotype by cell shape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (43), 17253-17258 (2013).
- Penjweini, R., Loew, H. G., Hamblin, M. R., Kratky, K. W. Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of PVP-Hypericin: A new strategy using ms pulses of LED and the fluorescent dye CFSE. Journal of Microscopy. 45 (1), 100-108 (2012).
