Time-Lapse 2D Imaging dell'attività fagocitica in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures
Summary
In questo studio è stata esaminata l’attività fagocitica dei macrofagi contro le cellule tumorali, in particolare le cellule carcinoma mammario dei topi da 4T1. Il modello di cocoltura a cellule vive è stato stabilito e osservato utilizzando una combinazione di microscopia a contrasto di interferenza fluorescente e differenziale. Questa valutazione è stata immaginata utilizzando un software di imaging per sviluppare video time-lapse multipunto.
Abstract
I macrofagi associati al tumore (TAM) sono stati identificati come una componente importante per la crescita del tumore, l’invasione, la metastasi e la resistenza alle terapie tumorali. Tuttavia, i macrofagi associati al tumore possono essere dannosi per il tumore a seconda del microambiente tumorale e possono alterare reversibilmente le loro caratteristiche fenotipiche antagonizzando l’attività citotossica delle cellule immunitarie o migliorando la risposta antitumorale. Le azioni molecolari dei macrofagi e le loro interazioni con le cellule tumorali (ad esempio, la fagocitosi) non sono state ampiamente studiate. Pertanto, l’interazione tra le cellule immunitarie (M1/M2-sottotipo TAM) e le cellule tumorali nel microambiente tumorale è ora al centro della ricerca sull’immunoterapia del cancro. Nel presente studio, è stato sviluppato un modello di cocultura di cellule vive di macrofagi M1 indotti e cellule carcinoma 4T1 mammaria indotta per valutare l’attività fagocitica dei macrofagi utilizzando una funzione video time-lapse utilizzando la microscopia di contrasto di fase, fluorescente e contrasto differenziale (DIC). Il metodo attuale può osservare e documentare l’imaging multipunto a cellule vive della fagocitosi. La fagocitosi di 4T1 cellule da macrofagi M1 può essere osservata utilizzando la microscopia fluorescente prima di colorare le cellule 4T1 con carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE). La pubblicazione attuale descrive come co-cocoltura macrofagi e cellule tumorali in un unico piatto di imaging, polarizzare i macrofagi M1 e registrare eventi multipunto di macrofagi che inghiottiscono le cellule 4T1 durante 13 h di cocultura.
Introduction
I macrofagi sono la prima linea di difesa immunitaria e svolgono un ruolo nell’orchestrazione delle risposte immunitarie contro agenti patogeni e materiali estranei, comprese le cellule tumorali. Sono un fagocitato specializzato che distrugge e si sbarazza delle particelle indesiderate nel corpo. I macrofagi contribuiscono a funzioni difensive come lo sgombero di cellule e microrganismi apoptotici e il reclutamento di altre cellule immunitarie1. I macrofagi possono differenziarsi in due tipi diversi, i macrofagi M1 e M2, in risposta ai segnali ambientali2. I macrofagi polarizzati M1 (cioè i macrofagi attivati classicamente) vengono attivati dall’interferone-interferone-interferone-interferone-citochina (IFN-z) e dai lipopolisiari (LPS) e sono coinvolti nella risposta, nella clearance degli agenti patogeni, nell’efficiente fagocitosi infiammatoria e nell’immunità tumoricidala3,4. I macrofagi M2 sono strettamente correlati ai macrofagi associati al tumore (ARM) e hanno proprietà di promozione antiinfiammatorie e tumorale4.
Fagocitosi, derivata dall’antico greco (phagein), che significa “divorare”, (kytos), che significa “cellula” e -osis, che significa “processo”5. La fagocitosi è un processo mediato dal recettore in cui i fagociti (compresi macrofagi, monociti e neutrofili) uccidono e inghiottiscono agenti patogeni invasori, ripuliscono le particelle estranee e ripuliscono i detriti cellulari apoptotici. I macrofagi associati al tumore (TAM) si trovano nello stroma in diversi tumori, tra cui il cancro al seno, e hanno funzioni pro-tumore6,7, con conseguente resistenza alla fagocitosi. Il meccanismo dettagliato della fagocitosi delle cellule tumorali da parte dei macrofagi non è ancora compreso.
Questo studio presenta un metodo in due fasi: 1) 4T1 cellule di carcinoma mammario e macrofagi polarizzati M1 sono costati, e 2) l’attività fagocistica dei macrofagi viene valutata utilizzando la microscopia video a cellule vive. Il coloranti fluorescente CFSE è stato utilizzato per macchiare le cellule carcinoma mammario del topo 4T1. La macchia etichetta le cellule 4T1 per distinguerle dai macrofagi M1 cocolto all’interno di un singolo piatto di imaging. I macrofagi RAW 264,7 sono polarizzati con LPS e IFN-z in un fenotipo M1. Per garantire una polarizzazione completa, è stata eseguita l’immunostaining con anticorpo anti-iNOS coniugato al FITC. Successivamente, è stata acquisita una serie multipunto di immagini time-lapse per osservare più eventi, tra cui la fagocitosi, all’interno della cocultura.
Una migliore comprensione delle interazioni tra cellule tumorali e macrofagi può portare a una potenziale immunoterapia del cancro. L’imaging a cellule vive offre una visione dettagliata della dinamica cellulare in un ambiente in tempo reale ed è stata utilizzata per studiare la migrazione cellulare, lo screening fenotipico, l’apoptosi e la citotossicità8,9 in neuroscienze, biologia dello sviluppo e scoperta di farmaci. Anche se il tumore proposto in questo studio è il cancro al seno, il metodo può essere applicato anche a più cellule bersaglio e cellule echeggiatrici distinte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo descritto richiede due passaggi: 1) cocultura di 4T1 cellule carcinoma mammario e macrofagi polarizzati M1, e 2) valutazione dell’attività fagocitica del macrofago utilizzando la microscopia time-lapse. La cocultura delle cellule vive è ampiamente utilizzata nella fagocitosi e nei saggi di migrazione. Il modello di cocoltura a cellule vive qui è un semplice, procedura in vitro adattabile (Figura 2) che utilizza un colore fluorescente, CFSE, che viene utilizzato per etichetta…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato finanziariamente da Geran Putra Berimpak (GBP), Universiti Putra Malaysia: 9542800. Ringraziamo i laboratori Agro-Biotechnology Institute, Malaysia (ABI) e la struttura di microscopia. Un ringraziamento speciale a Mohd Daniel Hazim per l’aiuto nell’editing e nella registrazione del video sperimentale per questo lavoro.
Materials
| Anti-INOS antibody conjugated FITC | Miltenyi Biotec | REA982 | 150 µg in 1 mL |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Invitrogen | C1157 | 25 mg |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | 10 mg |
| DMEM/high glucose | HyClone | SH30003.04 | 670.0 g |
| Fetal bovine serum | Tico Europe | FBSEU500 | 500 mL |
| Lipopolysaccharides | Sigma | L4516-1MG | 1 mg |
| Mouse recombinant interferon-gamma | Stemcell Technologies | 78021 | 100 µg |
| Penicillin-streptomycin solution | Cellgro | 30-003-CI | 100 mL |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | 10 pack |
| Trypsin EDTA | Cellgro | 25-052-CI | 1X, 100 mL |
| 1000 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-01-052 | 5000 tips/case |
| 2 mL serological pipette | JET BIOFIL | GSP012002 | Non-pryogenic |
| 200 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-02-302 | 20,000 tps/case |
| 25 cm2 cell culture flask | Corning | CLS430639 | Tissue culture treated |
| Bench top centrifuge | Dynamica | FA15C | Model: Velocity 14R |
| Biological safety fume hood | Nuaire | NU-565-400 | Model: Home/ LabGard® ES TE NU-565 Class II, Type B2 Biosafety Fume Hood |
| CO2/air mixer | Chamlide (Live Cell Instrument) | FC-R-20 | FC-5 (CO2/Air Mixer) with the flow meter |
| Cell scrapper | NEST | 710001 | 220 mm |
| CO2 cell incubator | Panasonic | N/A | Model: MCO-19M(UV) |
| Confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Ti-Eclipse |
| Glass bottom dish | Ibidi | 81218-200 | 35 mm |
| NIS elements software | Nikon Instruments Inc. | Available online download | |
| Pipette controller | CappAid | PA-100 | CappController pipette controller, 0.1-100ml |
| Thermostat | Shinko | Discontinued | JCS-33A 48 x 48 x 96.5mm |
Riferimenti
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