Time-Lapse 2D Imaging of Phagocytic Activity in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures
Summary
En este estudio se tomó la imagen de la actividad fagocítica de macrófagos contra las células cancerosas, específicamente las células del carcinoma mamario del ratón 4T1. El modelo de cocultivo de células vivas se estableció y observó utilizando una combinación de microscopía de contraste de interferencia fluorescente y diferencial. Esta evaluación se realizó utilizando un software de imágenes para desarrollar vídeo de lapso de tiempo multipunto.
Abstract
Los macrófagos asociados a tumores (AMA) se han identificado como un componente importante para el crecimiento tumoral, la invasión, la metástasis y la resistencia a las terapias oncológicas. Sin embargo, los macrófagos asociados al tumor pueden ser perjudiciales para el tumor dependiendo del microambiente tumoral y pueden alterar de forma reversible sus características fenotípicas mediante la antagonización de la actividad citotóxica de las células inmunitarias o mejorando la respuesta antitumoral. Las acciones moleculares de los macrófagos y sus interacciones con las células tumorales (p. ej., fagocitosis) no se han estudiado ampliamente. Por lo tanto, la interacción entre las células inmunitarias (Tam de subtipo M1/M2) y las células cancerosas en el microambiente tumoral es ahora un foco de investigación de inmunoterapia contra el cáncer. En el presente estudio, se desarrolló un modelo de cocultivo de células vivas de macrófagos M1 inducidos y células de carcinoma 4T1 mamaria de ratón para evaluar la actividad fagocítica de los macrófagos utilizando una función de vídeo de lapso de tiempo utilizando la microscopía de contraste de fase, fluorescente y contraste de interferencia diferencial (DIC). El método actual puede observar y documentar imágenes multipunto de células vivas de fagocitosis. La fagocitosis de células 4T1 por macrófagos M1 se puede observar mediante microscopía fluorescente antes de manchar las células 4T1 con éster de succinimidil carboxifluoresceína (CFSE). La publicación actual describe cómo coculturar macrófagos y células tumorales en una sola placa de diagnóstico por imágenes, polarizar los macrófagos M1 y registrar eventos multipunto de macrófagos que envuelven células 4T1 durante 13 h de cocultura.
Introduction
Los macrófagos son la primera línea de defensa inmune y desempeñan un papel en la orquestación de respuestas inmunitarias contra patógenos y materiales extraños, incluidas las células cancerosas. Son un fagocito especializado que destruye y elimina las partículas no deseadas en el cuerpo. Los macrófagos aportan funciones defensivas como el aclaramiento de células apoptoticas y microorganismos y el reclutamiento de otras células inmunitarias1. Los macrófagos pueden diferenciarse en dos tipos diferentes, los macrófagos M1 y M2, en respuesta a las señales ambientales2. Los macrófagos polarizados en M1 (es decir, los macrófagos activados clásicamente) se activan mediante el interferón citoquina (IFN-o) y los lipopolisacáridos (LPS) y participan en la respuesta inflamatoria, el aclaramiento de patógenos, la fagocitosis eficiente y la inmunidadtumoralicida 3,4. Los macrófagos M2 están estrechamente relacionados con los macrófagos asociados a tumores (AMA) y tienen propiedades antiinflamatorias y de promoción tumoral4.
Fagocitosis, derivada del griego antiguo (favioina), que significa “devorar”, (kytos), que significa “célula”, y -osis, que significa “proceso”5. La fagocitosis es un proceso mediado por receptores en el que los fagocitos (incluidos macrófagos, monocitos y neutrófilos) matan y envuelven patógenos invasores, limpian partículas extrañas y limpian desechos de células apoptóticas claras. Los macrófagos asociados a tumores (AMA) se encuentran en el estroma en diferentes tumores, incluyendo el cáncer de mama, y tienen funciones protumorales6,7,lo que resulta en resistencia a la fagocitosis. Todavía no se entiende el mecanismo detallado de la fagocitosis de células tumorales por macrófagos.
Este estudio presenta un método de dos pasos: 1) las células de carcinoma mamario de ratón 4T1 y los macrófagos polarizados M1 están cocultivos, y 2) la actividad fagocítica de los macrófagos se evalúa mediante microscopía de vídeo de células vivas. El tinte fluorescente CFSE se utilizó para manchar las células del carcinoma mamario del ratón 4T1. La mancha etiqueta las células 4T1 para distinguirlas de los macrófagos M1 cocultivos dentro de una sola placa de imágenes. Los macrófagos RAW 264.7 se polarizan con LPS e IFN-o en un fenotipo M1. Para garantizar una polarización completa, se realizó inmunomancha con anticuerpos anti-iNOS conjugados a FITC. Posteriormente, se adquirió una serie multipunto de imágenes de lapso de tiempo para observar múltiples eventos, incluyendo fagocitosis, dentro de la cocultura.
Una mejor comprensión de las interacciones entre las células tumorales y los macrófagos puede conducir a una posible inmunoterapia contra el cáncer. La imagen de células en vivo ofrece una visión detallada de la dinámica celular en un entorno en tiempo real y se ha utilizado para estudiar la migración celular, el cribado fenotípico, la apoptosis y la citotoxicidad8,9 en neurociencia, biología del desarrollo y descubrimiento de fármacos. Aunque el tumor propuesto en este estudio es el cáncer de mama, el método también se puede aplicar a múltiples células diana y células efectoras distintas.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito requiere dos pasos: 1) cocultivo de células de carcinoma mamario de ratón 4T1 y macrófagos polarizados M1, y 2) evaluación de la actividad fagocítica de macrófagos mediante microscopía de lapso de tiempo. La cocultura de células vivas se utiliza ampliamente en fagocitosis y ensayos de migración. El modelo de cocultivo de células vivas aquí es un procedimiento in vitro simple y adaptable(Figura 2)que utiliza un tinte fluorescente, CFSE, que se utiliza para eti…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado financieramente por Geran Putra Berimpak (GBP), La Universiti Putra Malasia: 9542800. Nos gustaría dar las gracias al Instituto Agrobiotecnología, a los laboratorios de Malasia (ABI) y a la instalación de imágenes de microscopía. Un agradecimiento especial a Mohd Daniel Hazim por ayudar en la edición y grabación del vídeo experimental para este trabajo.
Materials
| Anti-INOS antibody conjugated FITC | Miltenyi Biotec | REA982 | 150 µg in 1 mL |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Invitrogen | C1157 | 25 mg |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | 10 mg |
| DMEM/high glucose | HyClone | SH30003.04 | 670.0 g |
| Fetal bovine serum | Tico Europe | FBSEU500 | 500 mL |
| Lipopolysaccharides | Sigma | L4516-1MG | 1 mg |
| Mouse recombinant interferon-gamma | Stemcell Technologies | 78021 | 100 µg |
| Penicillin-streptomycin solution | Cellgro | 30-003-CI | 100 mL |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | 10 pack |
| Trypsin EDTA | Cellgro | 25-052-CI | 1X, 100 mL |
| 1000 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-01-052 | 5000 tips/case |
| 2 mL serological pipette | JET BIOFIL | GSP012002 | Non-pryogenic |
| 200 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-02-302 | 20,000 tps/case |
| 25 cm2 cell culture flask | Corning | CLS430639 | Tissue culture treated |
| Bench top centrifuge | Dynamica | FA15C | Model: Velocity 14R |
| Biological safety fume hood | Nuaire | NU-565-400 | Model: Home/ LabGard® ES TE NU-565 Class II, Type B2 Biosafety Fume Hood |
| CO2/air mixer | Chamlide (Live Cell Instrument) | FC-R-20 | FC-5 (CO2/Air Mixer) with the flow meter |
| Cell scrapper | NEST | 710001 | 220 mm |
| CO2 cell incubator | Panasonic | N/A | Model: MCO-19M(UV) |
| Confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Ti-Eclipse |
| Glass bottom dish | Ibidi | 81218-200 | 35 mm |
| NIS elements software | Nikon Instruments Inc. | Available online download | |
| Pipette controller | CappAid | PA-100 | CappController pipette controller, 0.1-100ml |
| Thermostat | Shinko | Discontinued | JCS-33A 48 x 48 x 96.5mm |
Riferimenti
- Rostam, H. M., Reynolds, P. M., Alexander, M. R., Gadegaard, N., Ghaemmaghami, A. M. Image based Machine Learning for identification of macrophage subsets. Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).
- Mantovani, A., Sozzani, S., Locati, M., Allavena, P., Sica, A. Macrophage polarization: Tumor-associated macrophages as a paradigm for polarized M2 mononuclear phagocytes. Trends in Immunology. , (2002).
- Lee, K. Y. . M1 and M2 polarization of macrophages a mini-review. 2 (1), 1-5 (2019).
- Martinez-Marin, D., Jarvis, C., Nelius, T., Filleur, S. Assessment of phagocytic activity in live macrophages-tumor cells cocultures by Confocal and Nomarski Microscopy. Biology Methods and Protocols. 2 (1), 1-7 (2017).
- Tauber, A. I. Metchnikoff and the phagocytosis theory. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (11), 897-901 (2003).
- Eiro, N., Gonzalez, L. O., Cid, S., Schneider, J., Vizoso, F. J. Breast Cancer Tumor Stroma: Cellular Components, Phenotypic Heterogeneity, Intercellular Communication, Prognostic ImplicationsTherapeutic Opportunities. Cancers. 11 (5), 1-26 (2019).
- Larionova, I., et al. Interaction of tumor-associated macrophages and cancer chemotherapy. OncoImmunology. 8 (7), 1-15 (2019).
- Jain, P., Worthylake, R. A., Alahari, S. K. Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (63), e3585 (2012).
- Weiss, S., Luchman, H. A., Restall, I., Bozek, D. A., Chesnelong, C. Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion. Journal of Visualized Experiments. (138), e58152 (2018).
- Tsitsilashvili, E., Sepashvili, M., Chikviladze, M., Shanshiashvili, L., Mikeladze, D. Myelin basic protein charge isomers change macrophage polarization. Journal of Inflammation Research. 12, 25-33 (2019).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).
- Kobelt, G., Eriksson, J., Phillips, G., Berg, J. The burden of multiple sclerosis 2015: Methods of data collection, assessment and analysis of costs, quality of life and symptoms. Multiple Sclerosis Journal. 2, 153-156 (2017).
- Escórcio-Correia, M., Hagemann, T. Measurement of tumor cytolysis by macrophages. Current Protocols in Immunology. , 1-11 (2011).
- Cui, K., Ardell, C. L., Podolnikova, N. P., Yakubenko, V. P. Distinct migratory properties of M1, M2, and resident macrophages are regulated by αdβ2and αmβ2integrin-mediated adhesion. Frontiers in Immunology. 9, 1-14 (2018).
- McWhorter, F. Y., Wang, T., Nguyen, P., Chung, T., Liu, W. F. Modulation of macrophage phenotype by cell shape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (43), 17253-17258 (2013).
- Penjweini, R., Loew, H. G., Hamblin, M. R., Kratky, K. W. Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of PVP-Hypericin: A new strategy using ms pulses of LED and the fluorescent dye CFSE. Journal of Microscopy. 45 (1), 100-108 (2012).
