M1マクロファージ-4T1マウス乳腺癌細胞における食細胞活性のタイムラプス2Dイメージング
Summary
癌細胞に対するマクロファージ貪食活性、具体的には4T1マウス乳腺癌細胞を、本研究で画像化した。生細胞共培養モデルを確立し、蛍光干渉造影造影顕微鏡の組み合わせを用いて観察した。この評価は、イメージングソフトウェアを使用して画像化し、マルチポイントタイムラプスビデオを開発しました。
Abstract
腫瘍関連マクロファージ(AM)は、腫瘍の増殖、浸潤、転移、および癌治療に対する耐性の重要な構成要素として同定されている。しかし、腫瘍関連マクロファージは、腫瘍の微小環境に応じて腫瘍に有害であり、免疫細胞の細胞傷害活性に拮抗するか、または抗腫瘍応答を増強することによって、その表型特性を可逆的に変化させることができる。マクロファージの分子作用と腫瘍細胞との相互作用(例えば、食作用)は広く研究されていない。そこで、腫瘍微小環境における免疫細胞(M1/M2サブタイプTAM)とがん細胞との相互作用は、現在、がん免疫療法研究の焦点になっている。本研究では、誘導M1マクロファージおよびマウス乳腺4T1癌細胞の生細胞共培養モデルを開発し、位相コントラスト、蛍光、および差動干渉コントラスト(DIC)顕微鏡を用いてタイムラプスビデオ機能を用いてマクロファージの貪食活性を評価した。本方法は、食細胞症の多点生細胞イメージングを観察し、文書化することができる。M1マクロファージによる4T1細胞の貪食は、カルボキシフルオレセインコハシニミジルエステル(CFSE)で4T1細胞を染色する前に蛍光顕微鏡を用いて観察することができる。本研究では、マクロファージと腫瘍細胞を単一のイメージング皿で共培養し、M1マクロファージを偏光させ、13時間の共培養中に4T1細胞を巻き込むマクロファージのマルチポイントイベントを記録する方法について説明している。
Introduction
マクロファージは免疫防御の第一線であり、癌細胞を含む病原体や異物に対する免疫応答を調整する役割を果たしています。彼らは破壊し、体内の不要な粒子を取り除く特殊な食細胞です。マクロファージは、アポトーシス細胞や微生物のクリアランスや他の免疫細胞1の募集などの防御機能に寄与する。マクロファージは、環境信号2に応答して、M1とM2マクロファージの2つの異なるタイプに区別することができます。M1偏光マクロファージ(すなわち、古典的に活性化されたマクロファージ)は、サイトカインインターフェロンγ(IFN-γ)およびリポ多糖(LPS)によって活性化され、炎症反応、病原体クリアランス、効率的な貪食、および腫瘍性免疫3、4に関与する。M2マクロファージは、腫瘍関連マクロファージ(AM)と密接に関連しており、抗炎症および腫瘍促進特性4を有する。
古代ギリシア語(ファゲイン)に由来する食細胞症は、「食べる」(キトス)を意味し、「細胞」を意味し、-osisは「プロセス」5を意味します。食細胞症は、食細胞(マクロファージ、単球、好中球を含む)が病原体を殺して巻き込み、異物を浄化し、アポトーシス細胞破片を除去する受容体媒介性プロセスです。腫瘍関連マクロファージ(AM)は、乳癌を含む異なる腫瘍の間質に見出され、プロ腫瘍機能6、7を有し、食細胞症に対する耐性をもたらす。マクロファージによる腫瘍細胞食作用の詳細なメカニズムはまだ分かっていない。
本研究は、1)4T1マウス乳腺癌細胞とM1偏光マクロファージが共培養され、2)マクロファージの貪食活性を生細胞ビデオ顕微鏡を用いて評価する2段階の方法を提示する。CFSE蛍光色素を用いて、4T1マウス乳腺癌細胞を染色した。染色は4T1細胞にラベルを付け、単一の画像皿内で養成されたM1マクロファージと区別する。RAW 264.7マクロファージは、LPSおよびIFN-γと共極化され、M1表現型に変調される。完全な偏光を確保するために、FITCに共役した抗iNOS抗体を用いた免疫染色を行った。その後、共培養中に食細胞症を含む複数の事象を観察するために、マルチポイントシリーズのタイムラプス画像を取得した。
腫瘍細胞とマクロファージ間の相互作用をよりよく理解することは、潜在的な癌免疫療法につながる可能性があります。生細胞イメージングは、リアルタイムの設定で細胞ダイナミクスの詳細なビューを提供し、神経科学、発生生物学、および創薬における細胞移動、フェノチピックスクリーニング、アポトーシス、および細胞毒性8、9の研究に使用されています。本研究で提案された腫瘍は乳癌であるが、この方法は複数の標的細胞および明確なエフェクター細胞にも適用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
記載されたプロトコルは、2つのステップを必要とする:1)4T1マウス乳腺癌細胞およびM1偏光マクロファージの共培養、および2)タイムラプス顕微鏡を用いたマクロファージ貪食活性の評価。生細胞共培養は、食細胞症および遊走アッセイに広く使用されている。ここでの生細胞共培養モデルは、4T1標的細胞の標識に使用される蛍光色素CFSEを利用した、シンプルで適応可能なインビトロ手順(<stron…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、ジェラン・プトラ・ベリムパック(GBP)、大学プトラマレーシア:9542800によって財政的に資金提供されました。アグロバイオテクノロジー研究所、マレーシア(ABI)研究所、顕微鏡画像設備に感謝申し上げたいと思います。この作品の実験ビデオの編集と録画に協力してくれてありがとう。
Materials
| Anti-INOS antibody conjugated FITC | Miltenyi Biotec | REA982 | 150 µg in 1 mL |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Invitrogen | C1157 | 25 mg |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | 10 mg |
| DMEM/high glucose | HyClone | SH30003.04 | 670.0 g |
| Fetal bovine serum | Tico Europe | FBSEU500 | 500 mL |
| Lipopolysaccharides | Sigma | L4516-1MG | 1 mg |
| Mouse recombinant interferon-gamma | Stemcell Technologies | 78021 | 100 µg |
| Penicillin-streptomycin solution | Cellgro | 30-003-CI | 100 mL |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | 10 pack |
| Trypsin EDTA | Cellgro | 25-052-CI | 1X, 100 mL |
| 1000 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-01-052 | 5000 tips/case |
| 2 mL serological pipette | JET BIOFIL | GSP012002 | Non-pryogenic |
| 200 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-02-302 | 20,000 tps/case |
| 25 cm2 cell culture flask | Corning | CLS430639 | Tissue culture treated |
| Bench top centrifuge | Dynamica | FA15C | Model: Velocity 14R |
| Biological safety fume hood | Nuaire | NU-565-400 | Model: Home/ LabGard® ES TE NU-565 Class II, Type B2 Biosafety Fume Hood |
| CO2/air mixer | Chamlide (Live Cell Instrument) | FC-R-20 | FC-5 (CO2/Air Mixer) with the flow meter |
| Cell scrapper | NEST | 710001 | 220 mm |
| CO2 cell incubator | Panasonic | N/A | Model: MCO-19M(UV) |
| Confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Ti-Eclipse |
| Glass bottom dish | Ibidi | 81218-200 | 35 mm |
| NIS elements software | Nikon Instruments Inc. | Available online download | |
| Pipette controller | CappAid | PA-100 | CappController pipette controller, 0.1-100ml |
| Thermostat | Shinko | Discontinued | JCS-33A 48 x 48 x 96.5mm |
Riferimenti
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