Time-lapse 2D Imaging av phagocytic aktivitet i M1 macrophage-4T1 Mouse Brystkreftceller i co-kulturer
Summary
Macrophage phagocytic aktivitet mot kreftceller, spesielt 4T1 mus melke kreftceller, ble avbildet i denne studien. Den levende celle coculture modellen ble etablert og observert ved hjelp av en kombinasjon av fluorescerende og differensial forstyrrelser kontrast mikroskopi. Denne vurderingen ble avbildet ved hjelp av bildeprogramvare for å utvikle multipunkt time-lapse video.
Abstract
Tumor-assosiert makrofager (TAMs) har blitt identifisert som en viktig komponent for tumor vekst, invasjon, metastasering, og motstand mot kreft terapi. Men tumor-assosiert makrofager kan være skadelig for svulsten avhengig av tumor mikromiljøet og kan reverserbart endre sine fenotypiske egenskaper ved enten antagonizing den cytotoksisk aktiviteten av immunceller eller forsterke anti-tumor respons. De molekylære handlingene til makrofager og deres interaksjon med tumorceller (f. eks, fagocytose) har ikke blitt grundig studert. Derfor samspillet mellom immunceller (M1/m2-under type TAM) og kreftceller i tumor mikromiljøet er nå et fokus for kreft immunterapi forskning. I denne studien, en levende celle coculture modell av indusert M1 makrofager og mus melke 4T1 kreftceller ble utviklet for å vurdere phagocytic aktiviteten til makrofager bruker en time-lapse video funksjon ved hjelp av fase-kontrast, fluorescerende, og differensial forstyrrelser kontrast (DIC) mikroskopi. Den nåværende metoden kan observere og dokumentere multipunkt Live-celle Imaging av fagocytose. Fagocytose av 4T1 celler av M1 makrofager kan observeres ved hjelp av fluorescerende mikroskopi før farging 4T1 celler med carboxyfluorescein succinimidyl Ester (CFSE). Den nåværende publikasjonen beskriver hvordan du coculture makrofager og tumorceller i en enkelt tenkelig parabol, polariserer M1 makrofager, og posten multipunkt hendelser av makrofager henger 4T1 celler i løpet av 13 h av coculture.
Introduction
Makrofager er den første linjen av immunforsvaret og spille en rolle i orkestrering immunresponser mot patogener og utenlandske materialer, inkludert kreftceller. De er en spesialisert phagocyte som ødelegger og blir kvitt uønskede partikler i kroppen. Makrofager bidrar med defensive funksjoner som clearance av apoptotisk celler og mikroorganismer og rekruttering av andre immunceller1. Makrofager kan differensiere til to forskjellige typer, M1 og m2 makrofager, som svar på Miljøsignaler2. M1-polarisert makrofager (dvs. klassisk aktiverte makrofager) aktiveres av cytokin interferon-γ (IFN-γ) og lipopolysaccharides (LPS) og er involvert i inflammatorisk respons, patogen klaring, effektiv fagocytose, og tumoricidal immunitet3,4. M2 makrofager er nært beslektet med tumor-assosiert makrofager (TAMs) og har anti-inflammatorisk og tumor forfremmelse egenskaper4.
Fagocytose, avledet fra antikkens greske (phagein), som betyr “å sluke” (kytos), som betyr “celle” og-Osis, som betyr “prosess”5. Fagocytose er en reseptor-mediert prosess der phagocytes (inkludert makrofager, monocytter, og nøytrofile) drepe og sluker invaderende patogener, rydde opp fremmede partikler, og klare apoptotisk celle rusk. Tumor-Associated makrofager (TAMs) er funnet i stroma i ulike svulster, inkludert brystkreft, og har Pro-tumor funksjoner6,7, noe som resulterer i resistens mot fagocytose. Den detaljerte mekanismen av tumor celle fagocytose av makrofager er ennå ikke forstått.
Denne studien presenterer en to-trinns metode: 1) 4T1 mus melke kreftceller og M1-polarisert makrofager er cocultured, og 2) den phagocytic aktiviteten til makrofager er vurdert ved hjelp av Live-celle video mikroskopi. CFSE fluorescerende fargestoff ble brukt til å beis 4T1 mus melke kreftceller. Flekken etikettene 4T1 celler for å skille dem fra cocultured M1 makrofager innenfor en enkelt tenkelig parabolen. RAW 264,7 makrofager er polarisert med LPS og IFN-γ til en M1 fenotype. For å sikre en fullstendig polarisering, immunostaining med anti-iNOS antistoff som ble bøyd til FITC ble utført. Deretter ble det anskaffet en flerpunkts serie med tidsforløpbilder for å observere flere hendelser, inkludert fagocytose, i coculture.
En bedre forståelse av samspillet mellom tumorceller og makrofager kan føre til potensiell kreft immunterapi. Live-celle Imaging gir en detaljert visning av mobilnettet dynamikk i sann tidsinnstilling og har blitt brukt til å studere celle migrasjon, fenotypiske screening, apoptose og cytotoksisitet8,9 i nevrovitenskap, utviklingspsykologi biologi og narkotika oppdagelse. Selv om den foreslåtte svulsten i denne studien er brystkreft, kan metoden også brukes på flere målceller og distinkte Effektor celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen beskrevet krever to trinn: 1) coculture av 4T1 mus melke kreftceller og M1-polarisert makrofager, og 2) vurdering av macrophage phagocytic aktivitet ved hjelp av time-lapse mikroskopi. Levende celle coculture er mye brukt i fagocytose og migrasjon analyser. Den levende celle coculture modellen her er en enkel, tilpasningsdyktig in vitro prosedyre (figur 2) som utnytter en fluorescerende fargestoff, CFSE, som brukes til å merke 4T1 målrettede celler. Dette brukes til riktig spor…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble økonomisk finansiert av geran Putra Berimpak (GBP), Universiti Putra Malaysia: 9542800. Vi vil gjerne takke Agro-bioteknologi Institute, Malaysia (ABI) laboratorier, og mikroskopi Imaging anlegget. Spesiell takk til Mohd Daniel Hazim for hjelp med redigering og innspilling av eksperimentell video for dette arbeidet.
Materials
| Anti-INOS antibody conjugated FITC | Miltenyi Biotec | REA982 | 150 µg in 1 mL |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Invitrogen | C1157 | 25 mg |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | 10 mg |
| DMEM/high glucose | HyClone | SH30003.04 | 670.0 g |
| Fetal bovine serum | Tico Europe | FBSEU500 | 500 mL |
| Lipopolysaccharides | Sigma | L4516-1MG | 1 mg |
| Mouse recombinant interferon-gamma | Stemcell Technologies | 78021 | 100 µg |
| Penicillin-streptomycin solution | Cellgro | 30-003-CI | 100 mL |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | 10 pack |
| Trypsin EDTA | Cellgro | 25-052-CI | 1X, 100 mL |
| 1000 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-01-052 | 5000 tips/case |
| 2 mL serological pipette | JET BIOFIL | GSP012002 | Non-pryogenic |
| 200 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-02-302 | 20,000 tps/case |
| 25 cm2 cell culture flask | Corning | CLS430639 | Tissue culture treated |
| Bench top centrifuge | Dynamica | FA15C | Model: Velocity 14R |
| Biological safety fume hood | Nuaire | NU-565-400 | Model: Home/ LabGard® ES TE NU-565 Class II, Type B2 Biosafety Fume Hood |
| CO2/air mixer | Chamlide (Live Cell Instrument) | FC-R-20 | FC-5 (CO2/Air Mixer) with the flow meter |
| Cell scrapper | NEST | 710001 | 220 mm |
| CO2 cell incubator | Panasonic | N/A | Model: MCO-19M(UV) |
| Confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Ti-Eclipse |
| Glass bottom dish | Ibidi | 81218-200 | 35 mm |
| NIS elements software | Nikon Instruments Inc. | Available online download | |
| Pipette controller | CappAid | PA-100 | CappController pipette controller, 0.1-100ml |
| Thermostat | Shinko | Discontinued | JCS-33A 48 x 48 x 96.5mm |
Riferimenti
- Rostam, H. M., Reynolds, P. M., Alexander, M. R., Gadegaard, N., Ghaemmaghami, A. M. Image based Machine Learning for identification of macrophage subsets. Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).
- Mantovani, A., Sozzani, S., Locati, M., Allavena, P., Sica, A. Macrophage polarization: Tumor-associated macrophages as a paradigm for polarized M2 mononuclear phagocytes. Trends in Immunology. , (2002).
- Lee, K. Y. . M1 and M2 polarization of macrophages a mini-review. 2 (1), 1-5 (2019).
- Martinez-Marin, D., Jarvis, C., Nelius, T., Filleur, S. Assessment of phagocytic activity in live macrophages-tumor cells cocultures by Confocal and Nomarski Microscopy. Biology Methods and Protocols. 2 (1), 1-7 (2017).
- Tauber, A. I. Metchnikoff and the phagocytosis theory. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (11), 897-901 (2003).
- Eiro, N., Gonzalez, L. O., Cid, S., Schneider, J., Vizoso, F. J. Breast Cancer Tumor Stroma: Cellular Components, Phenotypic Heterogeneity, Intercellular Communication, Prognostic ImplicationsTherapeutic Opportunities. Cancers. 11 (5), 1-26 (2019).
- Larionova, I., et al. Interaction of tumor-associated macrophages and cancer chemotherapy. OncoImmunology. 8 (7), 1-15 (2019).
- Jain, P., Worthylake, R. A., Alahari, S. K. Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (63), e3585 (2012).
- Weiss, S., Luchman, H. A., Restall, I., Bozek, D. A., Chesnelong, C. Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion. Journal of Visualized Experiments. (138), e58152 (2018).
- Tsitsilashvili, E., Sepashvili, M., Chikviladze, M., Shanshiashvili, L., Mikeladze, D. Myelin basic protein charge isomers change macrophage polarization. Journal of Inflammation Research. 12, 25-33 (2019).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).
- Kobelt, G., Eriksson, J., Phillips, G., Berg, J. The burden of multiple sclerosis 2015: Methods of data collection, assessment and analysis of costs, quality of life and symptoms. Multiple Sclerosis Journal. 2, 153-156 (2017).
- Escórcio-Correia, M., Hagemann, T. Measurement of tumor cytolysis by macrophages. Current Protocols in Immunology. , 1-11 (2011).
- Cui, K., Ardell, C. L., Podolnikova, N. P., Yakubenko, V. P. Distinct migratory properties of M1, M2, and resident macrophages are regulated by αdβ2and αmβ2integrin-mediated adhesion. Frontiers in Immunology. 9, 1-14 (2018).
- McWhorter, F. Y., Wang, T., Nguyen, P., Chung, T., Liu, W. F. Modulation of macrophage phenotype by cell shape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (43), 17253-17258 (2013).
- Penjweini, R., Loew, H. G., Hamblin, M. R., Kratky, K. W. Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of PVP-Hypericin: A new strategy using ms pulses of LED and the fluorescent dye CFSE. Journal of Microscopy. 45 (1), 100-108 (2012).
