Time-Lapse 2D Imaging of Phagocytic Activity in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures
Summary
A atividade fagocítica do macrófago contra as células cancerosas, especificamente as células carcinomas mamárias do camundongo 4T1, foi imagemda neste estudo. O modelo de cocultura de células vivas foi estabelecido e observado por meio de uma combinação de microscopia de contraste de interferência fluorescente e diferencial. Esta avaliação foi imagemdo usando o software de imagem para desenvolver multiponto de vídeo time-lapse.
Abstract
Macrófagos associados ao tumor (TAMs) têm sido identificados como um componente importante para o crescimento do tumor, invasão, metástase e resistência às terapias contra o câncer. No entanto, macrófagos associados ao tumor podem ser prejudiciais ao tumor, dependendo do microambiente tumoral e podem alterar reversivelmente suas características fenotípicas, antagonizando a atividade citotóxica das células imunes ou melhorando a resposta antitumoral. As ações moleculares dos macrófagos e suas interações com células tumorais (por exemplo, fagocitose) não foram amplamente estudadas. Portanto, a interação entre as células imunes (M1/M2-subtipo TAM) e células cancerosas no microambiente tumoral é agora um foco da pesquisa de imunoterapia do câncer. No presente estudo, foi desenvolvido um modelo de cocultura celular ao vivo de macrófagos M1 induzidos e células carcinoma mamárias de camundongos 4T1 para avaliar a atividade fagocítica dos macrófagos usando um recurso de vídeo de lapso de tempo usando microscopia de contraste de interferência de contraste de fase, fluorescente e diferencial (DIC). O método atual pode observar e documentar imagens multiponto de células vivas de fagocitose. A fagocitose das células 4T1 por macrófagos M1 pode ser observada usando microscopia fluorescente antes de colorir células 4T1 com esucinta de carboxyfluorescein (CFSE). A publicação atual descreve como cocultura macrófagos e células tumorais em um único prato de imagem, polarizar macrófagos M1, e gravar eventos multiponto de macrófagos engolindo células 4T1 durante 13 h de cocultura.
Introduction
Macrófagos são a primeira linha de defesa imunológica e desempenham um papel na orquestração de respostas imunes contra patógenos e materiais estranhos, incluindo células cancerosas. Eles são um phagocito especializado que destrói e se livra de partículas indesejadas no corpo. Macrófagos contribuem com funções defensivas, como a limpeza de células apoptóticas e microorganismos e o recrutamento de outras células imunes1. Macrófagos podem se diferenciar em dois tipos diferentes, macrófagos M1 e M2, em resposta aos sinais ambientais2. Macrófagos polarizados por M1 (ou seja, macrófagos ativados classicamente) são ativados pelo interferon-γ de citocina (IFN-γ) e lipopolissaccharides (LPS) e estão envolvidos na resposta inflamatória, limpeza de patógenos, fagocitose eficiente e imunidade tumoricida3,4. Os macrófagos M2 estão intimamente relacionados com macrófagos associados ao tumor (TAMs) e têm propriedades de promoção anti-inflamatória etumoral 4.
A fagocitose, derivada do grego antigo (fagetina), que significa “devorar”, (kytos), que significa “célula” e osis, que significa “processo”5. A fagocitose é um processo mediado por receptores, onde os fagócitos (incluindo macrófagos, monócitos e neutrófilos) matam e engolfam patógenos invasores, limpam partículas estranhas e limpam detritos de células apoptóticas. Macrófagos associados ao tumor (TAMs) são encontrados no estroma em diferentes tumores, incluindo câncer de mama, e têm funçõespró-tumorais 6,7,resultando em resistência à fagocitose. O mecanismo detalhado da fagocitose celular tumoral por macrófagos ainda não é compreendido.
Este estudo apresenta um método de duas etapas: 1) as células carcinoma mamárias de camundongos 4T1 e macrófagos polarizados por M1 são coculturados, e 2) a atividade fagoscítica dos macrófagos é avaliada usando microscopia de vídeo de células vivas. O corante fluorescente CFSE foi usado para manchar as células do carcinoma mamária do camundongo 4T1. A mancha rotula as células 4T1 para distingui-las dos macrófagos M1 coculturados dentro de um único prato de imagem. Raw 264.7 macrófagos são polarizados com LPS e IFN-γ em um fenótipo M1. Para garantir uma polarização completa, foi realizada a imunocoloração com anticorpoanti-iNOS conjugado ao FITC. Posteriormente, uma série multiponto de imagens de lapso de tempo foi adquirida para observar vários eventos, incluindo a fagocitose, dentro da cocultura.
Uma melhor compreensão das interações entre células tumorais e macrófagos pode levar à imunoterapia potencial do câncer. Imagens de células vivas oferece uma visão detalhada da dinâmica celular em um ambiente em tempo real e tem sido usado para estudar a migração celular, triagem de ofenotípico, apoptose e citotoxicidade8,9 em neurociência, biologia do desenvolvimento, e descoberta de drogas. Embora o tumor proposto neste estudo seja câncer de mama, o método também pode ser aplicado a múltiplas células-alvo e células efetentes distintas.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo descrito requer duas etapas: 1) cocultura de células carcinoma mamárias 4T1 e macrófagos polarizados por M1 e 2) avaliação da atividade fagocítica do macrófago usando microscopia de lapso de tempo. A cocultura de células vivas é amplamente utilizada na falese e ensaios migratórios. O modelo de cocultura de células vivas aqui é um procedimento simples e adaptável in vitro(Figura 2)que utiliza um corante fluorescente, cfse, que é usado para rotular as células-alvo 4T…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado financeiramente por Geran Putra Berimpak (GBP), Universidades Putra Malásia: 9542800. Gostaríamos de agradecer aos laboratórios do Instituto Agro-Biotecnologia, malásia (ABI) e à instalação de imagem de microscopia. Um agradecimento especial a Mohd Daniel Hazim para ajudar na edição e gravação do vídeo experimental para este trabalho.
Materials
| Anti-INOS antibody conjugated FITC | Miltenyi Biotec | REA982 | 150 µg in 1 mL |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Invitrogen | C1157 | 25 mg |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | 10 mg |
| DMEM/high glucose | HyClone | SH30003.04 | 670.0 g |
| Fetal bovine serum | Tico Europe | FBSEU500 | 500 mL |
| Lipopolysaccharides | Sigma | L4516-1MG | 1 mg |
| Mouse recombinant interferon-gamma | Stemcell Technologies | 78021 | 100 µg |
| Penicillin-streptomycin solution | Cellgro | 30-003-CI | 100 mL |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | 10 pack |
| Trypsin EDTA | Cellgro | 25-052-CI | 1X, 100 mL |
| 1000 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-01-052 | 5000 tips/case |
| 2 mL serological pipette | JET BIOFIL | GSP012002 | Non-pryogenic |
| 200 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-02-302 | 20,000 tps/case |
| 25 cm2 cell culture flask | Corning | CLS430639 | Tissue culture treated |
| Bench top centrifuge | Dynamica | FA15C | Model: Velocity 14R |
| Biological safety fume hood | Nuaire | NU-565-400 | Model: Home/ LabGard® ES TE NU-565 Class II, Type B2 Biosafety Fume Hood |
| CO2/air mixer | Chamlide (Live Cell Instrument) | FC-R-20 | FC-5 (CO2/Air Mixer) with the flow meter |
| Cell scrapper | NEST | 710001 | 220 mm |
| CO2 cell incubator | Panasonic | N/A | Model: MCO-19M(UV) |
| Confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Ti-Eclipse |
| Glass bottom dish | Ibidi | 81218-200 | 35 mm |
| NIS elements software | Nikon Instruments Inc. | Available online download | |
| Pipette controller | CappAid | PA-100 | CappController pipette controller, 0.1-100ml |
| Thermostat | Shinko | Discontinued | JCS-33A 48 x 48 x 96.5mm |
Riferimenti
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