I mioblasti stanno proliferando cellule precursori che si differenziano per formare miotubi polinucleati e infine mitole muscolari scheletriche. Qui, presentiamo un protocollo per un isolamento efficiente e la cultura dei mioblasti primari dai muscoli scheletrici dei topi giovani adulti. Il metodo consente studi molecolari, genetici e metabolici delle cellule muscolari in coltura.
I mioblasti primari sono precursori indifferenziati della proliferazione del muscolo scheletrico. Possono essere coltivati e studiati come precursori muscolari o indotti a differenziarsi nelle fasi successive dello sviluppo muscolare. Il protocollo qui fornito descrive un metodo robusto per l’isolamento e la coltura di una popolazione altamente prolifera di cellule mioblaste da espeamanti muscolari scheletrici di topi giovani adulti. Queste cellule sono utili per lo studio delle proprietà metaboliche del muscolo scheletrico di diversi modelli murini, così come in altre applicazioni a valle come la trasfezione con DNA esogeno o la trasduzione con vettori di espressione virale. Il livello di differenziazione e profilo metabolico di queste cellule dipende dalla durata dell’esposizione e dalla composizione dei supporti utilizzati per indurre la differenziazione del mioblasto. Questi metodi forniscono un sistema robusto per lo studio del metabolismo delle cellule muscolari del topo ex vivo. È importante sottolineare che, a differenza dei modelli in vivo, i metodi qui descritti forniscono una popolazione cellulare che può essere ampliata e studiata con alti livelli di riproducibilità.
Mentre spesso citato come un’indicazione della salute metabolica generale, più studi hanno dimostrato che l’indice di massa corporea (BMI) negli adulti più anziani non è costantemente associato con un rischio più elevato di mortalità. Ad oggi, l’unico fattore dimostrato di essere coerente con la mortalità ridotta in questa popolazione è l’aumento della massa muscolare1. Il tessuto muscolare rappresenta una delle più grandi fonti di cellule sensibili all’insulina nel corpo, ed è quindi fondamentale nel mantenimento dell’omeostasi metabolica complessiva2. L’attivazione del tessuto muscolare scheletrico tramite esercizio fisico è associata ad aumenti sia nella sensibilità all’insulina locale che nella salute metabolica generale3. Mentre i modelli in vivo sono essenziali per studiare la fisiologia muscolare e l’impatto della funzione muscolare sul metabolismo integrato, le colture primarie dei miotubi forniscono un sistema trattabile che riduce la complessità degli studi sugli animali.
I mioblasti derivati dai muscoli post-natali possono essere utilizzati per studiare l’impatto di numerose condizioni di trattamento e crescita in modo altamente riproducibile. Questo è stato a lungo riconosciuto e diversi metodi per l’isolamento del mioblasto e la cultura sono stati descritti4,5,6,7,8,9. Alcuni di questi metodi utilizzano muscoli neoiatali e producono un numero relativamente basso di mioblasti5,8, che richiedono diversi animali per studi su larga scala. Inoltre, i metodi più diffusi per coltivare i mioblasti utilizzano il “pre-placcatura” per arricchire per i mioblasti, che sono meno aderenti rispetto ad altri tipi di cellule. Abbiamo trovato il metodo di arricchimento alternativo descritto qui per essere molto più efficiente e riproducibile per arricchire una popolazione di mioblasti altamente proliferante. In sintesi, questo protocollo consente l’isolamento dei mioblasti altamente proliferanti dagli espianti muscolari giovani adulti, attraverso l’escrescenza in mezzi di coltura. I mioblasti possono essere raccolti ripetutamente, per diversi giorni, rapidamente espansi e indotti a differenziarsi in miotubi. Questo protocollo genera riproducibilmente un gran numero di cellule mioblaste sane che si differenziano robustamente in miotubi spontaneamente contraenti. Ci ha permesso di studiare il metabolismo e i ritmi circadiani nei miotubi primari di topi di una varietà di genotipi. Infine, includiamo metodi per preparare miotubi per lo studio del metabolismo ossidativo, utilizzando misurazioni dei tassi di consumo di ossigeno in piastre 96-well.
Il muscolo scheletrico è vitale per l’istituzione e il mantenimento dell’omeostasi metabolica11. Lo studio della fisiologia muscolare è complicato dalla variabilità interindividuale, così come la difficoltà nell’ottenere campioni, in particolare nel caso di studi umani. Miotubes primari coltivati hanno dimostrato di ricapitolare molte caratteristiche della fisiologia muscolare, tra cui l’omeostasi di calcio12, rigenerazione del tessuto muscolare danneggiato<sup class="…
The authors have nothing to disclose.
Gli autori sono grati al Dr. Matthew Watt presso l’Università di Melbourne e Dr. Anastasia Kralli presso la Johns Hopkins University per l’assistenza adottando questo protocollo basato sul lavoro di Mokbel et al.6. Ringraziamo anche la dott.ssa Sabine Jordan per l’assistenza nello sviluppo e nell’adozione di questo protocollo nel nostro laboratorio. Questo lavoro è stato finanziato dai National Institutes of Health R01s DK097164 e Da DK112927 a K.A.L.
Coating Solution: | |||
DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
Collagen | Life Technologies | A1064401 | 1.7 mL |
Matrigel | Fisher | CB40234A | 1 mL |
Plating Media: | |||
DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL |
HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL |
Heat Inactivated FBS | Life Technologies | 16000044 | 20 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 minutes |
Amniomax | Life Technologies | 12556023 | 5 mL |
Myoblast Media: | |||
DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL |
HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL |
Heat Inactivated FBS | Life Technologies | 16000044 | 10 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 minutes |
Amniomax | Life Technologies | 12556023 | 5 mL |
Differentiation Media: | |||
DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
Heat Inactivated Horse Serum | Sigma | H1138 | 1.5 mL |
Insulin-Selenium-Transferrin | Life Technologies | 41400045 | 0.5 mL |
Other Materials: | |||
PBS | Gibco | 14040133 | |
Gentamicin | Sigma | G1397 | |
TrypLE | Gibco | 12604013 | |
DMSO | Sigma | 472301 | Prepare as 10% DMSO in Myoblast Media for freezing cells |
Forceps | Any | ||
Razor Blades | Any | ||
Scissors | Any | ||
Whatman paper | VWR | 21427-648 | |
60 mm plate | VWR | 734-2318 | |
10 cm plate | VWR | 25382-428 (CS) | |
T25 Flasks | ThermoFisher | 156367 | |
T75 Flasks | ThermoFisher | 156499 | |
Centrifuge Tubes (15mL) | BioPioneer | CNT-15 | |
Oxygen Consumption Rates: | |||
Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | Seahorse XFe96 Analyzer | Instrument used to measure oxygen consumption rates read out by acidification of the extracellular media |
Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | 96-well plates for use in XFe96 Analyzer |
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below |
Seahorse XF Palmitate-BSA FAO substrate | Agilent | 102720-100 | components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below |
Palmitic acid | Sigma | P5585-10G | for measurement of fatty acid oxidation |
carnitine | Sigma | C0283-5G | for measurement of fatty acid oxidation |
Etomoxir | Sigma | E1905 | for measurement of fatty acid oxidation |
BSA | Sigma | A7030 | used as control or in conjugation with palmitic acid for use in measurement of fatty acid oxidation |