Isolering og differentiering af primære Myoblaster fra mus skeletmuskulatur Explants
Summary
Myoblaster er prolifererende prækursorceller, der differentierer til dannelse af polynucleerede myotubes og i sidste ende skeletmuskulatur myofibers. Her præsenterer vi en protokol for effektiv isolation og kultur af primære myoblaster fra unge voksne mus skeletmuskulatur. Metoden muliggør molekylære, genetiske og metaboliske undersøgelser af muskelceller i kulturen.
Abstract
Primære myoblaster er udifferentierede prolifererende forstadier af skeletmuskulatur. De kan dyrkes og undersøgt som muskel prækursorer eller induceret til at differentiere i senere stadier af muskel udvikling. Den protokol, der gives her beskriver en robust metode til isolation og kultur af en meget proliferativ population af fremmer celler fra unge voksne mus skeletmuskulatur explants. Disse celler er nyttige for studiet af de metaboliske egenskaber af skeletmuskulatur af forskellige musemodeller, såvel som i andre downstream applikationer såsom transfektering med eksogen DNA eller transduktion med viral Expression vektorer. Graden af differentiering og metaboliske profil af disse celler afhænger af eksponeringens længde, og sammensætningen af de medier, der anvendes til at inducere fremmer differentiering. Disse metoder giver et robust system til undersøgelse af muse muskel cellemetabolisme ex vivo. Vigtigere, i modsætning til in vivo-modeller, de metoder, der er beskrevet her, giver en cellepopulation, som kan udvides og undersøgt med høje niveauer af reproducerbarhed.
Introduction
Mens ofte citeret som en indikation af samlede metaboliske sundhed, flere undersøgelser har vist, at Body Mass Index (BMI) hos ældre voksne ikke er konsekvent forbundet med højere risiko for dødelighed. Til dato, den eneste faktor vist at være i overensstemmelse med reduceret dødelighed i denne population er øget muskel masse1. Muskelvæv repræsenterer en af de største kilder til insulin-følsomme celler i kroppen, og er derfor kritisk i vedligeholdelsen af den samlede metaboliske homøostase2. Aktivering af skeletmuskulatur væv via motion er forbundet med stigninger i både lokale insulinfølsomhed og samlede metaboliske sundhed3. Mens in vivo modeller er afgørende for at studere muskel fysiologi og virkningen af muskelfunktion på integreret metabolisme, primære kulturer af myotubes giver en Tractable system, der reducerer kompleksiteten af dyreforsøg.
Myoblaster afledt af postnatale muskler kan bruges til at undersøge virkningen af talrige behandling og vækstbetingelser i en meget reproducerbar måde. Dette har længe været anerkendt, og flere metoder til fremmer isolation og kultur er blevet beskrevet4,5,6,7,8,9. Nogle af disse metoder bruger neonatal muskler og giver relativt lavt antal myoblaster5,8, der kræver flere dyr til større skala undersøgelser. Også, mest udbredte metoder til dyrkning myoblaster bruge “pre-plating” at berige for myoblaster, som er mindre Veder end andre celletyper. Vi har fundet den alternative berigende metode, der er beskrevet her, for at være langt mere effektiv og reproducerbar for at berige en meget proliferativ fremmer-population. Sammenfattende giver denne protokol mulighed for isolering af meget proliferativ myoblaster fra unge voksne muskel explants, via udvækst til kultur medier. Myoblaster kan høstes gentagne gange, over flere dage, hurtigt ekspanderet, og induceret til at skelne til myotubes. Denne protokol genererer reproducerbart et stort antal raske fremmer-celler, der i høj grad adskiller sig i spontant trækninger myotubes. Det har gjort det muligt for os at studere metabolisme og døgnrytme i primære myotubes af mus af en række genotyper. Endelig omfatter vi metoder til fremstilling af myotubes til undersøgelse af oxidativ metabolisme, ved hjælp af målinger af iltforbrug satser i 96-brønd plader.
Protocol
Representative Results
Discussion
Skeletmuskulatur er afgørende for etablering og vedligeholdelse af metabolisk homøostase11. Studiet af muskel fysiologi kompliceres af den interindividuelle variation, samt vanskeligheder med at få prøver, især i tilfælde af humane undersøgelser. Kulturperler primære myotubes har vist sig at rekapitulere mange funktioner i muskel fysiologi, herunder calcium homøostase12, regenerering af beskadigede muskelvæv5, metaboliske ændringer som rea…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne er taknemmelig for Dr. Matthew watt på University of Melbourne og Dr. Anastasia Kralli på Johns Hopkins University for at hjælpe med at vedtage denne protokol baseret på arbejdet i Mokbel et al.6. Vi takker også Dr. Sabine Jordan for hjælp til at udvikle og vedtage denne protokol i vores laboratorium. Dette arbejde blev finansieret af National Institutes of Health R01s DK097164 og DK112927 at K.A.L.
Materials
| Coating Solution: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
| Collagen | Life Technologies | A1064401 | 1.7 mL |
| Matrigel | Fisher | CB40234A | 1 mL |
| Plating Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL |
| Heat Inactivated FBS | Life Technologies | 16000044 | 20 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 minutes |
| Amniomax | Life Technologies | 12556023 | 5 mL |
| Myoblast Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL |
| Heat Inactivated FBS | Life Technologies | 16000044 | 10 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 minutes |
| Amniomax | Life Technologies | 12556023 | 5 mL |
| Differentiation Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
| Heat Inactivated Horse Serum | Sigma | H1138 | 1.5 mL |
| Insulin-Selenium-Transferrin | Life Technologies | 41400045 | 0.5 mL |
| Other Materials: | |||
| PBS | Gibco | 14040133 | |
| Gentamicin | Sigma | G1397 | |
| TrypLE | Gibco | 12604013 | |
| DMSO | Sigma | 472301 | Prepare as 10% DMSO in Myoblast Media for freezing cells |
| Forceps | Any | ||
| Razor Blades | Any | ||
| Scissors | Any | ||
| Whatman paper | VWR | 21427-648 | |
| 60 mm plate | VWR | 734-2318 | |
| 10 cm plate | VWR | 25382-428 (CS) | |
| T25 Flasks | ThermoFisher | 156367 | |
| T75 Flasks | ThermoFisher | 156499 | |
| Centrifuge Tubes (15mL) | BioPioneer | CNT-15 | |
| Oxygen Consumption Rates: | |||
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | Seahorse XFe96 Analyzer | Instrument used to measure oxygen consumption rates read out by acidification of the extracellular media |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | 96-well plates for use in XFe96 Analyzer |
| Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below |
| Seahorse XF Palmitate-BSA FAO substrate | Agilent | 102720-100 | components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below |
| Palmitic acid | Sigma | P5585-10G | for measurement of fatty acid oxidation |
| carnitine | Sigma | C0283-5G | for measurement of fatty acid oxidation |
| Etomoxir | Sigma | E1905 | for measurement of fatty acid oxidation |
| BSA | Sigma | A7030 | used as control or in conjugation with palmitic acid for use in measurement of fatty acid oxidation |
Riferimenti
- Srikanthan, P., Karlamangla, A. S. Muscle mass index as a predictor of longevity in older adults. American Journal of Medicine. 127 (6), 547-553 (2014).
- Lee-Young, R. S., Kang, L., Ayala, J. E., Wasserman, D. H., Fueger, P. T. The physiological regulation of glucose flux into muscle in vivo. Journal of Experimental Biology. 214 (2), 254-262 (2010).
- Sjøberg, K. A., et al. Exercise increases human skeletal muscle insulin sensitivity via coordinated increases in microvascular perfusion and molecular signaling. Diabetes. 66 (6), 1501-1510 (2017).
- Girgis, C. M., Clifton-Bligh, R. J., Mokbel, N., Cheng, K., Gunton, J. E. Vitamin D signaling regulates proliferation, differentiation, and myotube size in C2C12 skeletal muscle cells. Endocrinology. 155 (2), 347-357 (2014).
- Smith, J., Merrick, D. Embryonic skeletal muscle microexplant culture and isolation of skeletal muscle stem cells. Methods in Molecular Biology. 633, 29-56 (2010).
- Mokbel, N., et al. K7del is a common TPM2 gene mutation associated with nemaline myopathy and raised myofibre calcium sensitivity. Brain. 136 (2), 494-507 (2013).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270, 725-727 (1977).
- Rando, T. A., Blau, H. M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. Journal of Cell Biology. 125 (6), 1275-1287 (1994).
- Musarò, A., Carosio, S. Isolation and Culture of Satellite Cells from Mouse Skeletal Muscle. Methods in Molecular Biology. 1553, 155-167 (2017).
- Smolina, N., Bruton, J., Kostareva, A., Sejersen, T. Assaying mitochondrial respiration as an indicator of cellular metabolism and fitness. Methods in Molecular Biology. 1601, 79-87 (2017).
- Elliott, B., Renshaw, D., Getting, S., Mackenzie, R. The central role of myostatin in skeletal muscle and whole body homeostasis. Acta Physiologica. 205 (3), 324-340 (2012).
- Smolina, N., Kostareva, A., Bruton, J., Karpushev, A., Sjoberg, G., Sejersen, T. Primary murine myotubes as a model for investigating muscular dystrophy. BioMed Research International. , (2015).
- Nedachi, T., Fujita, H., Kanzaki, M. Contractile C 2 C 12 myotube model for studying exercise-inducible responses in skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 295 (5), E1191-E1204 (2008).
- Chen, M. B., et al. Impaired activation of AMP-kinase and fatty acid oxidation by globular adiponectin in cultured human skeletal muscle of obese type 2 diabetics. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 90 (6), 3665-3672 (2005).
- Douillard-Guilloux, G., Mouly, V., Caillaud, C., Richard, E. Immortalization of murine muscle cells from lysosomal α-glucosidase deficient mice: A new tool to study pathophysiology and assess therapeutic strategies for Pompe disease. Biochemical and Biophysical Research Communications. 388 (2), 333-338 (2009).
- Varga, B., et al. Myotube elasticity of an amyotrophic lateral sclerosis mouse model. Scientific Reports. 8 (1), 5917 (2018).
- Kriebs, A., et al. Circadian repressors CRY1 and CRY2 broadly interact with nuclear receptors and modulate transcriptional activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (33), 8776-8781 (2017).
- Cho, Y., et al. Perm1 enhances mitochondrial biogenesis, oxidative capacity, and fatigue resistance in adult skeletal muscle. FASEB Journal. 30 (2), 674-687 (2016).
