Isolering och differentiering av primära myoblasts från mus skelettmuskel Explants
Summary
Myoblaster är prolifererande föregångare celler som differentierar för att bilda polynukleerade myotubes och så småningom skelettmuskel myofibers. Här presenterar vi ett protokoll för effektiv isolering och kultur av primära myoblasts från unga vuxna mus skelett muskler. Metoden möjliggör molekylära, genetiska och metaboliska studier av muskelceller i kulturen.
Abstract
Primära myoblasts är odifferentierade prolifererande prekursorer av skelettmuskulaturen. De kan odlas och studeras som muskelprekursorer eller induceras för att differentiera i senare stadier av muskelutveckling. Det protokoll som anges här beskriver en robust metod för isolering och kultur av en mycket proliferativ population av myoblast celler från unga vuxna mus skelettmuskel explants. Dessa celler är användbara för studiet av de metabola egenskaperna hos skelettmuskulaturen i olika möss modeller, liksom i andra nedströms applikationer såsom transfektion med exogent DNA eller transduktion med viral Expression vektorer. Graden av differentiering och metabolisk profil av dessa celler beror på längden av exponeringen, och sammansättningen av de medier som används för att inducera myoblast differentiering. Dessa metoder ger ett robust system för studiet av mus muskel cell metabolism ex vivo. Viktigare, till skillnad från in vivo modeller, de metoder som beskrivs här ger en cellpopulation som kan utökas och studeras med höga nivåer av reproducerbarhet.
Introduction
Medan ofta nämns som en indikation på övergripande metabolisk hälsa, flera studier har visat att body mass index (BMI) hos äldre vuxna är inte konsekvent förknippad med högre risk för dödlighet. Hittills, den enda faktor som visat sig vara förenligt med minskad dödlighet i denna population är ökad muskelmassa1. Muskelvävnad representerar en av de största källorna till insulin känsliga celler i kroppen, och är därför avgörande för upprätthållandet av övergripande metabolisk homeostas2. Aktivering av skelettmuskulaturen vävnad via motion är förknippad med ökningar i både lokal insulinkänslighet och övergripande metabolisk hälsa3. Medan in vivo modeller är viktiga för att studera muskelfysiologi och effekterna av muskelfunktion på integrerad metabolism, primära kulturer av myotubes ger ett tractable system som minskar komplexiteten i djurstudier.
Myoblaster som härrör från postnatal muskler kan användas för att studera effekten av många behandlings-och tillväxtförhållanden på ett mycket reproducerbart sätt. Detta har länge erkänts och flera metoder för myoblast isolering och kultur har beskrivits4,5,6,7,8,9. Några av dessa metoder använder neonatal muskler och avkastning relativt lågt antal myoblasts5,8, kräver flera djur för större skala studier. Också, mest använda metoder för odling myoblaster använder “förplätering” att berika för myoblasts, som är mindre anhängare än andra celltyper. Vi har funnit den alternativa anriknings metoden som beskrivs här för att vara mycket mer effektiv och reproducerbar för berikande en mycket proliferativ myoblast population. Sammanfattnings, detta protokoll möjliggör isolering av mycket proliferativa myoblasts från unga vuxna muskel explants, via utväxt till kultur media. Myoblasts kan skördas upprepade gånger, under flera dagar, snabbt expanderat, och induceras för att differentiera till myotubes. Detta protokoll reproducerbart genererar ett stort antal friska myoblast celler som robust differentiera till spontant ryckningar myotubes. Det har gjort det möjligt för oss att studera metabolism och dygnsrytm i primära myotubes av möss i en mängd olika genotyper. Slutligen, vi inkluderar metoder för att förbereda myotubes för studiet av oxidativ metabolism, med mätningar av syreförbrukning i 96-bra tallrikar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Skelettmuskulaturen är avgörande för upprättande och underhåll av metabolisk homeostas11. Studiet av muskelfysiologi kompliceras av interindividuell variabilitet, samt svårighet att få prover, särskilt när det gäller humanstudier. Odlade primära myotubes har visat sig recapitulate många funktioner i muskelfysiologi, inklusive kalcium homeostas12, förnyelse av skadad muskelvävnad5, metaboliska förändringar som svar på övning<sup clas…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna är tacksamma för Dr Matthew watt vid University of Melbourne och Dr Anastasia Kralli vid Johns Hopkins University för att få hjälp med att anta detta protokoll baserat på arbetet i Mokbel et al.6. Vi tackar också Dr Sabine Jordan för hjälp att utveckla och anta detta protokoll i vårt laboratorium. Detta arbete finansierades av National Institutes of Health R01s DK097164 och DK112927 till K.A.L.
Materials
| Coating Solution: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
| Collagen | Life Technologies | A1064401 | 1.7 mL |
| Matrigel | Fisher | CB40234A | 1 mL |
| Plating Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL |
| Heat Inactivated FBS | Life Technologies | 16000044 | 20 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 minutes |
| Amniomax | Life Technologies | 12556023 | 5 mL |
| Myoblast Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL |
| Heat Inactivated FBS | Life Technologies | 16000044 | 10 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 minutes |
| Amniomax | Life Technologies | 12556023 | 5 mL |
| Differentiation Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
| Heat Inactivated Horse Serum | Sigma | H1138 | 1.5 mL |
| Insulin-Selenium-Transferrin | Life Technologies | 41400045 | 0.5 mL |
| Other Materials: | |||
| PBS | Gibco | 14040133 | |
| Gentamicin | Sigma | G1397 | |
| TrypLE | Gibco | 12604013 | |
| DMSO | Sigma | 472301 | Prepare as 10% DMSO in Myoblast Media for freezing cells |
| Forceps | Any | ||
| Razor Blades | Any | ||
| Scissors | Any | ||
| Whatman paper | VWR | 21427-648 | |
| 60 mm plate | VWR | 734-2318 | |
| 10 cm plate | VWR | 25382-428 (CS) | |
| T25 Flasks | ThermoFisher | 156367 | |
| T75 Flasks | ThermoFisher | 156499 | |
| Centrifuge Tubes (15mL) | BioPioneer | CNT-15 | |
| Oxygen Consumption Rates: | |||
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | Seahorse XFe96 Analyzer | Instrument used to measure oxygen consumption rates read out by acidification of the extracellular media |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | 96-well plates for use in XFe96 Analyzer |
| Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below |
| Seahorse XF Palmitate-BSA FAO substrate | Agilent | 102720-100 | components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below |
| Palmitic acid | Sigma | P5585-10G | for measurement of fatty acid oxidation |
| carnitine | Sigma | C0283-5G | for measurement of fatty acid oxidation |
| Etomoxir | Sigma | E1905 | for measurement of fatty acid oxidation |
| BSA | Sigma | A7030 | used as control or in conjugation with palmitic acid for use in measurement of fatty acid oxidation |
Riferimenti
- Srikanthan, P., Karlamangla, A. S. Muscle mass index as a predictor of longevity in older adults. American Journal of Medicine. 127 (6), 547-553 (2014).
- Lee-Young, R. S., Kang, L., Ayala, J. E., Wasserman, D. H., Fueger, P. T. The physiological regulation of glucose flux into muscle in vivo. Journal of Experimental Biology. 214 (2), 254-262 (2010).
- Sjøberg, K. A., et al. Exercise increases human skeletal muscle insulin sensitivity via coordinated increases in microvascular perfusion and molecular signaling. Diabetes. 66 (6), 1501-1510 (2017).
- Girgis, C. M., Clifton-Bligh, R. J., Mokbel, N., Cheng, K., Gunton, J. E. Vitamin D signaling regulates proliferation, differentiation, and myotube size in C2C12 skeletal muscle cells. Endocrinology. 155 (2), 347-357 (2014).
- Smith, J., Merrick, D. Embryonic skeletal muscle microexplant culture and isolation of skeletal muscle stem cells. Methods in Molecular Biology. 633, 29-56 (2010).
- Mokbel, N., et al. K7del is a common TPM2 gene mutation associated with nemaline myopathy and raised myofibre calcium sensitivity. Brain. 136 (2), 494-507 (2013).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270, 725-727 (1977).
- Rando, T. A., Blau, H. M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. Journal of Cell Biology. 125 (6), 1275-1287 (1994).
- Musarò, A., Carosio, S. Isolation and Culture of Satellite Cells from Mouse Skeletal Muscle. Methods in Molecular Biology. 1553, 155-167 (2017).
- Smolina, N., Bruton, J., Kostareva, A., Sejersen, T. Assaying mitochondrial respiration as an indicator of cellular metabolism and fitness. Methods in Molecular Biology. 1601, 79-87 (2017).
- Elliott, B., Renshaw, D., Getting, S., Mackenzie, R. The central role of myostatin in skeletal muscle and whole body homeostasis. Acta Physiologica. 205 (3), 324-340 (2012).
- Smolina, N., Kostareva, A., Bruton, J., Karpushev, A., Sjoberg, G., Sejersen, T. Primary murine myotubes as a model for investigating muscular dystrophy. BioMed Research International. , (2015).
- Nedachi, T., Fujita, H., Kanzaki, M. Contractile C 2 C 12 myotube model for studying exercise-inducible responses in skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 295 (5), E1191-E1204 (2008).
- Chen, M. B., et al. Impaired activation of AMP-kinase and fatty acid oxidation by globular adiponectin in cultured human skeletal muscle of obese type 2 diabetics. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 90 (6), 3665-3672 (2005).
- Douillard-Guilloux, G., Mouly, V., Caillaud, C., Richard, E. Immortalization of murine muscle cells from lysosomal α-glucosidase deficient mice: A new tool to study pathophysiology and assess therapeutic strategies for Pompe disease. Biochemical and Biophysical Research Communications. 388 (2), 333-338 (2009).
- Varga, B., et al. Myotube elasticity of an amyotrophic lateral sclerosis mouse model. Scientific Reports. 8 (1), 5917 (2018).
- Kriebs, A., et al. Circadian repressors CRY1 and CRY2 broadly interact with nuclear receptors and modulate transcriptional activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (33), 8776-8781 (2017).
- Cho, Y., et al. Perm1 enhances mitochondrial biogenesis, oxidative capacity, and fatigue resistance in adult skeletal muscle. FASEB Journal. 30 (2), 674-687 (2016).
