Comparaison Metastatic Clear Cell Renal Cell Carcinoma Model Established in Mouse Kidney and on Chicken Chorioallantoic Membrane
Summary
Le carcinome rénal métastatique de cellules claires est une maladie sans modèle animal complet pour l’investigation préclinique complète. Ce protocole illustre deux nouveaux modèles animaux pour la maladie : le modèle orthotopique ment implanté de souris et le modèle chorioallantoic de membrane de poulet, qui démontrent la métastasis de poumon ressemblant à des cas cliniques.
Abstract
Le carcinome rénal métastatique à cellules claires (ccRCC) est le sous-type le plus commun du cancer du rein. Le ccRCC localisé a des résultats chirurgicaux favorables. Cependant, un tiers des patients de ccRCC développeront des métastases au poumon, qui est liée à un résultat très pauvre pour des patients. Malheureusement, aucune thérapie n’est disponible pour ce stade mortel, parce que le mécanisme moléculaire de la métastes reste inconnu. Il a été connu pendant 25 années que la perte de fonction du gène suppresseur de tumeur de von Hippel-Lindau (VHL) est pathognomonic du ccRCC. Cependant, aucun modèle de souris transgénique médicalement pertinent de ccRCC n’a été produit. Le but de ce protocole est d’introduire et de comparer deux modèles animaux nouvellement établis pour le ccRCC métastatique. La première est l’implantation rénale dans le modèle de souris. Dans notre laboratoire, le système d’édition de gènes CRISPR a été utilisé pour assommer le gène VHL dans plusieurs lignées cellulaires du CCR. L’implantation orthotopique des populations hétérogènes de ccRCC à la capsule rénale a créé de nouveaux modèles de ccRCC qui développent des métastases pulmonaires robustes chez les souris immunocompétentes. Le deuxième modèle est le système de membrane chorioallantoïque de poulet (CAM). Par rapport au modèle de souris, ce modèle est plus de temps, de travail, et rentable. Ce modèle a également soutenu la formation et l’intravasation robustes de tumeur. En raison de la courte période de 10 jours de la croissance de tumeur dans LA MCA, aucune métaste manifeste n’a été observée par immunohistochemistry (IHC) dans les tissus embryonnaires rassemblés. Cependant, quand la croissance de tumeur a été prolongée de deux semaines dans le poulet éclos, les lésions micrométastatiques de ccRCC ont été observées par IHC dans les poumons. Ces deux nouveaux modèles précliniques seront utiles pour étudier davantage le mécanisme moléculaire derrière la métastase, ainsi que pour établir de nouveaux xénogreffes dérivés du patient (PDX) vers le développement de nouveaux traitements pour le ccRCC métastatique.
Introduction
Le carcinome rénal de cellules (RCC) est le7ème cancer le plus commun aux Etats-Unis. Chaque année, on estime que 74 000 Américains sont nouvellement diagnostiqués, ce qui représente plus de 14 000 décès (le sous-type histologique à cellules claires, ou ccRCC, est le sous-type le plus courant, représentant environ 80 % des cas de CCR. Les patients présentant la malignité localisée sont traités avec la néphrectomie et ont un taux de survie favorable de 5 ans de 73%1. Cependant, 25%-30% des patients développent des métastases lointaines aux organes vitaux tels que les poumons, ayant pour résultat une survie moyenne pauvre de 13 mois et le taux de survie de 5 ans de seulement 11%1,2,3. Une meilleure compréhension du mécanisme métastatique est nécessaire pour améliorer les résultats mortels pour le ccRCC métastatique.
La perte du gène suppresseur de tumeur de VHL est une lésion génétique caractéristique observée dans une majorité de cas humains de ccRCC4,5,6,7. Cependant, le mécanisme oncogène précis de la perte de VHL dans ccRCC est inconnu. En outre, le statut d’expression VHL n’est pas prédictif des résultats dans ccRCC8. Notamment, en dépit de nombreuses tentatives à l’élimination de VHL rénal-épithélial-ciblé, les scientifiques n’ont pas réussi à générer l’anomalie rénale au-delà des lésions cystiques preneoplastic observées chez les souris9,même lorsqu’elles sont combinées avec la suppression d’autres suppresseurs de tumeur tels que PTEN et p5310. Ces résultats soutiennent l’idée que la perte de VHL seule est insuffisante pour la tumorigenesis ou la métastasie spontanée suivante.
Récemment, notre laboratoire a créé une nouvelle ligne cellulaire VHL knock-out (VHL-KO) en utilisant CRISPR/Cas9 médiation suppression du gène VHL dans la lignée cellulaire de la murine VHLMD ccRCC (RENCA, ou VHL-WT)11,12. Nous avons montré que VHL-KO est non seulement mesenchymal, mais favorise également la transition épithéliale à la transition mésenchymale (EMT) des cellules DEVH-WT12. EMT est connu pour jouer un rôle important dans le processus métastatique13. Nos travaux ont en outre montré que la métaste pulmonaire éloignée se produit seulement avec la co-implantation des cellules VHL-KO et VHL-WT dans le rein, soutenant un mécanisme coopératif de métastes. Fait important, notre modèle VHL-KO et VHL-WT orthotopiquement implanté mène aux métastases robustes de poumon, récapitulant les cas cliniques de ccRCC. Ce modèle spontané de ccRCC métastatique compense l’absence d’un modèle métastatique transgénique de souris, particulièrement dans le développement de nouveaux médicaments anti-métastases. Ce protocole démontre l’implantation rénale de capsule des populations hétérogènes de cellules des cellules renCA génétiquement modifiées.
Les modèles de CAM de poulet ont une longue histoire dans la recherche pour l’angiogenèse et la biologie de tumeur due à leurs nombreux avantages, comme résumé dans le tableau 114,15,16,17,18. En bref, la fenêtre de temps pour la croissance de tumeur de CAM est courte, permettant un maximum de 11 jours jusqu’à ce que le CAM soit détruit à l’éclosion du poulet16. Malgré le court temps de croissance, l’approvisionnement nutritionnel riche et l’état immunodéficient de l’embryon de poulet permettent l’engraftment de tumeur très efficace16,19,20,21. Enfin, le coût de chaque œuf fécondé est de 1 $, comparativement à plus de 100 $ pour une souris SCID. Ensemble, le modèle CAM peut servir de modèle animal alternatif précieux dans l’établissement de nouveaux PDX à une grande économie de temps et de coût par rapport à la souris. Dans ce protocole, nous avons évalué si le modèle était capable de récapituler la biologie du ccRCC métastatique observé dans le modèle orthotopic de souris.
| (SCID) Souris | Cam | Note | |
| Coût | 100 $ chacun | 1 $ chacun | Viabilité allant de 50 à 75 % |
| Besoin de logements barrière | Oui | non | Réduit davantage les coûts et simplifie la surveillance en série des tumeurs |
| Tumeur directement visible | non | Oui | Figure 3A |
| Temps de premier engraftment (RENCA) | 2 semaines | 2-4 jours | réf 14, 15 |
| Point final de la croissance (RENCA) | 3-6 semaines | 10 jours | réf 14, 15 |
| Métastasie (RENCA) observée | Oui | Oui chez les poussins | Figure 3D |
| Passages en série | Oui | Oui | réf 16-18 |
| Passage aux souris (RENCA) | Oui | Oui | Hu, J., et coll. under review (2019) |
| Maintenir l’hétérogénéité tumorale | Oui | Oui | Hu, J., et coll. under review (2019) |
Tableau 1 : Avantages et limitations des modèles souris et CAM. Ce tableau compare les deux modèles pour leurs avantages et leurs limites en termes de temps requis, de coût, de main-d’œuvre, ainsi que de biologie. Le modèle CAM présente des avantages d’efficacité, mais il a aussi ses propres limites en raison de la morphologie différente entre les oiseaux et les mammifères. Par conséquent, il est important de confirmer que le modèle peut conserver la biologie des xénogreffes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pour beaucoup de patients présentant des malignités épithéliales, la métastasie aux organes vitaux est la cause primaire de la mortalité. Par conséquent, il est essentiel de trouver le mécanisme sous-jacent et une nouvelle avenue de thérapie pour la maladie métastatique. Malheureusement, il y a un manque de modèles animaux ccRCC métastatiques pertinents. Le défi est en grande partie dû à l’incapacité de recréer ccRCC chez la souris en dépit de la génération de nombreux rein transgénique épithélia…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été financés par la subvention de démarrage de l’UCLA JCCC, la subvention UCLA 3R, le CTSI de l’UCLA et l’UC TRDRP (LW). Nous remercions l’installation d’imagerie préclinique de l’Institut Crump, le TPCL et le Département de médecine animale de laboratoire (DLAM) de l’UCLA pour leur aide dans le traitement des méthodes expérimentales. La cytométrie de flux a été exécutée dans l’UCLA Johnson Comprehensive Cancer Center (JCCC) et le Center for AIDS Research Cytometry Core Facility, qui est soutenu par les prix P30 CA016042 et 5P30 AI028697 de l’UCLA, et par le JCCC, l’UCLA AIDS Institute, la David Geffen School of Medicine de l’UCLA, le Bureau du chancelier de l’UCLA et le Bureau de recherche du vice-chancelier de l’UCLA. Les services de consultation en statistique et d’analyse des données ont été fournis par le ucla CTSI Biostatistics, Epidemiology, and Research Design (BERD) Program qui est soutenu par NIH/National Center for Advancing Translational Science UCLA CTSI Grant Number UL1TR001881.
Materials
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | 25053CI | |
| 8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit | Dremel | 8050-N/18 | |
| anti-VHL antibody | Abcam | ab135576 | |
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD Biosciences | 14-826-79 | |
| BD Pharm Lyse | BD Biosciences | 555899 | |
| BDGeneral Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| DAB Chromogen Kit | Biocare Medical | DB801R | |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Goldbio | LUCK-1G | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Gibco | LS14190250 | |
| DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R) | eBioscience | 14-6681-82 | |
| Ethanol 200 Proof | Cylinders Management | 43196-11 | Prepare 70% in water |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions | Fisher Scientific | 10-437-028 | |
| Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Fisherbrand Sterile Cotton Balls | Fisher Scientific | 22-456-885 | |
| FisherbrandHigh Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| FisherbrandPremium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Formaldehyde Soln., 4%, Buffered, pH 6.9 (approx. 10% Formalin soln.), For Histology | MilliporeSigma | 1.00496.5000 | |
| Hamilton customized syringe | Hamilton | 80408 | 25 µL, Model 702 SN, Gauge: 30, Point Style: 4, Angle: 30, Needle Length: 17 mm |
| HA-probe Antibody (Y-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc805 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit | Incubator Warehouse | HB1588D | |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein Animal Health | 1169567762 | |
| IVIS Lumina II In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | ||
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning | C354230 | |
| Medline Surgical Instrument Drape, Clear Adhesive, 24" x 18" | Medex Supply | MED-DYNJSD2158 | |
| OmniPur BSA, Fraction V [Bovine Serum Albumin] Heat Shock Isolation | MilliporeSigma | 2910-25GM | |
| Penicillin-Streptomycin Sollution, 100X, 10,000 IU Penicillin, 10,000ug/mL Streptomycin | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Pentobarbital Sodium | Sigma Aldrich | 57-33-0 | Prepare 1% in saline |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 115-035-062 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-045 | |
| Povidone-Iodine Solution USP, 10% (w/v), 1% (w/v) Available Iodine, for Laboratory Use | Ricca Chemical | 395516 | |
| pSicoR | Addgene | 11579 | |
| Puromycin dihydrochloride hydrate, 99%, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC227420500 | |
| Renca | ATCC | CRL-2947 | |
| RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine | Corning | 10040CV | |
| Scientific 96-Well Non-Skirted Plates, Low Profile | Fisher Scientific | AB-0700 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-200, 200 µl, 960 (10 racks of 96) | Thomas Scientific | 1159M40 | |
| Shipping Tape, Multipurpose, 1.89" x 109.4 Yd., Tan, Pack Of 6 Rolls | Office Depot | 220717 | |
| Suture | Ethicon | J385H | |
| Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4" | Moore Medical | 1634 | |
| Thermo-Chicken Heated Pad | K&H manufacturing | 1000 | |
| Tygon Clear Laboratory Tubing – 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet) | Tygon | AACUN017 | |
| VHL-KO | CRISPR/Cas9-mediated knockout of VHL, then lentivirally labeled with flag-tagged EGFP & firefly luciferase | ||
| VHL-WT | Lentivirally labeled with HA-tagged mStrawberry fluorescent protein & firefly luciferase | ||
| World Precision Instrument FORCEPS IRIS 10CM CVD SERR | Fisher Scientific | 50-822-331 | |
| Wound autoclips kit | Braintree scientific, inc. | ACS KIT | |
| Xylenes (Histological), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X3S-4 |
Riferimenti
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