Fare Böbreği ve Tavuk Koryoallantoik Membranda Kurulan Metastatik Berrak Hücreli Renal Hücreli Karsinom Modelinin Karşılaştırılması
Summary
Metastatik berrak hücreli renal hücreli karsinom kapsamlı bir klinik öncesi araştırma için kapsamlı bir hayvan modeli olmayan bir hastalıktır. Bu protokol hastalık için iki yeni hayvan modelini göstermektedir: ortonik olarak implante edilmiş fare modeli ve tavuk koryoallantoik membran modeli, her ikisi de klinik olgulara benzeyen akciğer metastazı göstermektedir.
Abstract
Metastatik berrak hücreli renal hücreli karsinom (ccRCC) böbrek kanserinin en sık görülen alt tipidir. Lokalize ccRCC olumlu bir cerrahi sonuç vardır. Ancak CCRCC hastalarının üçte birinde akciğerde metastaz gelişir ve bu da hastalar için çok kötü bir sonuçla ilişkilidir. Metastazın moleküler mekanizması bilinmediği için ne yazık ki, bu ölümcül evre için hiçbir tedavi mevcut değildir. Von Hippel-Lindau (VHL) tümör baskılayıcı genin fonksiyon kaybının ccRCC’nin pathognomonic olduğu 25 yıldır bilinmektedir. Ancak ccRCC’nin klinik olarak ilgili transgenik fare modeli oluşturulmamamıştır. Bu protokolün amacı, metastatik ccRCC için yeni kurulan iki hayvan modelini tanıtmak ve karşılaştırmaktır. Bunlardan ilki fare modeline böbrek implantasyonu. Laboratuvarımızda CRISPR gen düzenleme sistemi çeşitli RCC hücre hatlarında VHL genini devre dışı bıraktı. Heterojen ccRCC popülasyonlarının renal kapsüle ortotopik implantasyonu, immünyonlu farelerde sağlam akciğer metastazları geliştiren yeni ccRCC modellerini oluşturmıştır. İkinci model tavuk koryoallantoik membran (CAM) sistemidir. Fare modeliile karşılaştırıldığında, bu model daha fazla zaman, işçilik ve maliyet-etkin. Bu model aynı zamanda sağlam tümör oluşumunu ve intravazasyonunu da destekledi. CAM’de tümörün 10 günlük kısa büyümesi nedeniyle toplanan embriyo dokularında immünohistokimya (IHC) tarafından hiçbir metastaz gözlenmedi. Ancak yumurtadan çıkan tavukta tümör büyümesi iki hafta uzadığında akciğerlerde IHC tarafından mikrometastatik ccRCC lezyonları gözlendi. Bu iki yeni preklinik model metastazın arkasındaki moleküler mekanizmayı daha fazla incelemek ve metastatik ccRCC için yeni tedavilerin geliştirilmesine yönelik yeni, hasta kaynaklı ksenogreftler (PDXs) oluşturmak için yararlı olacaktır.
Introduction
Renal hücreli karsinom (RCC) Amerika Birleşik Devletleri’nde7 en sık görülen kanser. Her yıl, 74.000 Amerikalılar yeni teşhis olduğu tahmin edilmektedir, 14.000 ‘den fazla ölüm ler için muhasebe (Clear-cell histolojik alt tip, veya ccRCC, en yaygın alt tip, RCC olguların yaklaşık% 80’ini oluşturan. Lokalize maligniteli hastalar nefrektomi ile tedavi edilir ve 5 yıllıksağkalım oranı %73’tür 1. Ancak hastaların %25-30’u akciğerler gibi hayati organlara uzak metastazlar gelişir ve bu da ortalama 13 ay ve 5 yıllık sağkalım oranının sadece %11 ile sonuçlanmasınanedenolur. Metastatik ccRCC için ölümcül sonucu iyileştirmek için metastatik mekanizmanın daha iyi anlaşılması gerekir.
VHL tümör baskılayıcı genin in kaybı insan ccRCC olgularının çoğunda gözlenen bir ayırt edici genetik lezyondur4,5,6,7. Ancak ccRCC’de VHL kaybının kesin onkojenik mekanizması bilinmemektedir. Ayrıca, VHL ifade durumu ccRCC8sonucu tahmin değildir. Özellikle, renal-epitel hedefli VHL nakavt sayısız girişimlere rağmen, bilim adamları farelerde gözlenen preneoplastik kistik lezyonlar ötesinde böbrek anormalliği oluşturmak için başarısız oldu9, PTEN ve p5310gibi diğer tümör baskılayıcıların silinmesi ile kombine bile . Bu bulgular, VHL kaybının tek başına tümörigenez veya sonraki spontan metastaz için yetersiz olduğu fikrini desteklemez.
Son zamanlarda, laboratuvarımız yeni bir VHL knockout (VHL-KO) hücre hattı murine VHL + ccRCC hücre hattında VHL geninin CRISPR / Cas9 aracılı silme kullanarak oluşturulan11,12. Biz VHL-KO sadece mezenkimal olduğunu gösterdi, ama aynı zamanda mezenkimal geçiş epitel teşvik (EMT) VHL-WT hücrelerinin12. EMT metastatik süreçte önemli bir rol oynadığı bilinmektedir13. Çalışmalarımız ayrıca uzak akciğer metastazının sadece böbrekteki VHL-KO ve VHL-WT hücrelerinin birlikte implantasyonu ile oluştuğunu ve metastazın ortak mekanizmasını desteklediğini göstermiştir. Daha da önemlisi, ortotokik olarak implante edilen VHL-KO ve VHL-WT modelimiz, klinik ccRCC olgularını özetleyerek sağlam akciğer metastazlarına yol açabilmiştir. Bu spontan metastatik ccRCC modeli, özellikle yeni anti-metastaz ilaçlarının geliştirilmesinde transgenik metastatik fare modelinin eksikliğini telafi eder. Bu protokol, genetik mühendisliği renca hücrelerinin heterojen hücre popülasyonlarının renal kapsül implantasyonunu göstermektedir.
Tavuk CAM modelleri, Tablo 114,15,16,17,18’deözetlendiği gibi, çok sayıda avantajı nedeniyle anjiyogenez ve tümör biyolojisi araştırmalarında uzun bir geçmişe sahiptir. Kısaca, CAM tümör büyümesi için zaman penceresi kısa, CAM tavuk16kuluçka üzerine yok olana kadar 11 gün maksimum izin . Kısa büyüme süresine rağmen, tavuk embriyosu zengin beslenme kaynağı ve immünoeksik devlet çok verimli tümör engraftment 16 ,19,20,21sağlar. Son olarak, her döllenmiş yumurta maliyeti ~ $ 1, üzerinde 100 $ bir SCID fare için karşılaştırıldığında. Birlikte, CAM modeli fare ile karşılaştırıldığında zaman ve maliyet büyük bir tasarruf yeni PDXs kurulmasında değerli bir alternatif hayvan modeli olarak hizmet verebilir. Bu protokolde, modelin fare ortotopik modelinde gözlenen metastatik ccRCC’nin biyolojisini özetleyip özetleyemeyeceğini değerlendirdik.
| (SCID) Fare | CAM | Not | |
| Maliyet | >Her biri 100$ | ~$1’er | %50-75 arasında değişen canlılık |
| Bariyer muhafazaihtiyacı | Evet | № | Daha fazla maliyet azaltır ve tümörlerin seri izleme kolaylaştırır |
| Tümör doğrudan görünür | № | Evet | Şekil 3A |
| İlk engraftment zamanı (RENCA) | 2 hafta | 2-4 gün | hakem 14, 15 |
| Büyümenin bitiş noktası (RENCA) | 3-6 hafta | 10 gün | hakem 14, 15 |
| Metastaz (RENCA) gözlendi | Evet | Evet civciv | Şekil 3D |
| Seri pasajlar | Evet | Evet | ref 16-18 |
| Farelere Geçiş (RENCA) | Evet | Evet | Hu, J., ve diğerleri gözden geçiriliyor (2019) |
| Tümör heterojenliğini koruyun | Evet | Evet | Hu, J., ve diğerleri gözden geçiriliyor (2019) |
Tablo 1: Fare ve CAM modellerinin avantajları ve sınırlamaları. Bu tablo, iki modeli, gerekli zaman, maliyet, işçilik ve biyoloji açısından avantajları ve sınırlamaları açısından karşılaştırmaktadır. CAM modeli verimlilik avantajları vardır, ama aynı zamanda kuşlar ve memeliler arasındaki farklı morfolojinedeniyle kendi benzersiz sınırlamaları vardır. Bu nedenle, modelkenogreftlerin biyolojisini koruyabileceğini doğrulamak önemlidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Epitel maligniteleri olan birçok hastada, hayati organlara metastaz mortalitenin birincil nedenidir. Bu nedenle, altta yatan mekanizma ve metastatik hastalık için tedavi yeni bir yol bulmak esastır. Ne yazık ki, ilgili metastatik ccRCC hayvan modellerinin eksikliği vardır. Büyük ölçüde sorun çok sayıda transgenik böbrek epitel hedefli VHL nakavt faremodelleri9,10nesil rağmen farelerde ccRCC yeniden eksikliği kaynaklanmaktadır. Burada, fare ve ta…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma UCLA JCCC tohum hibe, UCLA 3R hibe, UCLA CTSI ve UC TRDRP (LW) tarafından finanse edilmiştir. Biz Crump Enstitüsü Preklinik Görüntüleme Tesisi, TPCL ve UCLA Laboratuvar Hayvan Tıbbı (DLAM) Deneysel yöntemlerile yardım için teşekkür ederiz. Akış sitometri ucla Johnson Kapsamlı Kanser Merkezi (JCCC) ve Merkezi AIDS Araştırma Akış Sitometri Çekirdek Tesisi ulusal Sağlık enstitüleri tarafından desteklenen yapıldı P30 CA016042 ve 5P30 AI028697, ve JCCC tarafından, UCLA AIDS Enstitüsü, David Geffen Tıp Fakültesi UCLA UCLA Şansölye Ofisi, ve UCLA Yardımcısı Araştırma Ofisi. İstatistik danışmanlık ve veri analizi hizmetleri UCLA CTSI Biyoistatistik, Epidemiyoloji ve Araştırma Tasarımı (BERD) Programı tarafından sağlanan NIH / Ulusal Merkezi Çeviri Bilim UCLA CTSI Grant Number UL1TR001881 İlerletme için desteklenir.
Materials
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | 25053CI | |
| 8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit | Dremel | 8050-N/18 | |
| anti-VHL antibody | Abcam | ab135576 | |
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD Biosciences | 14-826-79 | |
| BD Pharm Lyse | BD Biosciences | 555899 | |
| BDGeneral Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| DAB Chromogen Kit | Biocare Medical | DB801R | |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Goldbio | LUCK-1G | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Gibco | LS14190250 | |
| DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R) | eBioscience | 14-6681-82 | |
| Ethanol 200 Proof | Cylinders Management | 43196-11 | Prepare 70% in water |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions | Fisher Scientific | 10-437-028 | |
| Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Fisherbrand Sterile Cotton Balls | Fisher Scientific | 22-456-885 | |
| FisherbrandHigh Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| FisherbrandPremium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Formaldehyde Soln., 4%, Buffered, pH 6.9 (approx. 10% Formalin soln.), For Histology | MilliporeSigma | 1.00496.5000 | |
| Hamilton customized syringe | Hamilton | 80408 | 25 µL, Model 702 SN, Gauge: 30, Point Style: 4, Angle: 30, Needle Length: 17 mm |
| HA-probe Antibody (Y-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc805 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit | Incubator Warehouse | HB1588D | |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein Animal Health | 1169567762 | |
| IVIS Lumina II In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | ||
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning | C354230 | |
| Medline Surgical Instrument Drape, Clear Adhesive, 24" x 18" | Medex Supply | MED-DYNJSD2158 | |
| OmniPur BSA, Fraction V [Bovine Serum Albumin] Heat Shock Isolation | MilliporeSigma | 2910-25GM | |
| Penicillin-Streptomycin Sollution, 100X, 10,000 IU Penicillin, 10,000ug/mL Streptomycin | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Pentobarbital Sodium | Sigma Aldrich | 57-33-0 | Prepare 1% in saline |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 115-035-062 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-045 | |
| Povidone-Iodine Solution USP, 10% (w/v), 1% (w/v) Available Iodine, for Laboratory Use | Ricca Chemical | 395516 | |
| pSicoR | Addgene | 11579 | |
| Puromycin dihydrochloride hydrate, 99%, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC227420500 | |
| Renca | ATCC | CRL-2947 | |
| RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine | Corning | 10040CV | |
| Scientific 96-Well Non-Skirted Plates, Low Profile | Fisher Scientific | AB-0700 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-200, 200 µl, 960 (10 racks of 96) | Thomas Scientific | 1159M40 | |
| Shipping Tape, Multipurpose, 1.89" x 109.4 Yd., Tan, Pack Of 6 Rolls | Office Depot | 220717 | |
| Suture | Ethicon | J385H | |
| Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4" | Moore Medical | 1634 | |
| Thermo-Chicken Heated Pad | K&H manufacturing | 1000 | |
| Tygon Clear Laboratory Tubing – 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet) | Tygon | AACUN017 | |
| VHL-KO | CRISPR/Cas9-mediated knockout of VHL, then lentivirally labeled with flag-tagged EGFP & firefly luciferase | ||
| VHL-WT | Lentivirally labeled with HA-tagged mStrawberry fluorescent protein & firefly luciferase | ||
| World Precision Instrument FORCEPS IRIS 10CM CVD SERR | Fisher Scientific | 50-822-331 | |
| Wound autoclips kit | Braintree scientific, inc. | ACS KIT | |
| Xylenes (Histological), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X3S-4 |
Riferimenti
- Cohen, H. T., McGovern, F. J. Renal-cell carcinoma. The New England Journal of Medicine. 353 (23), 2477-2490 (2005).
- Bianchi, M., et al. Distribution of metastatic sites in renal cell carcinoma: a population-based analysis. Annals of Oncology. 23 (4), 973-980 (2012).
- Hsieh, J. J., et al. Renal cell carcinoma. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17009 (2017).
- Foster, K., et al. Somatic mutations of the von Hippel-Lindau disease tumour suppressor gene in non-familial clear cell renal carcinoma. Human Molecular Genetics. 3, (1994).
- Young, A. C., et al. Analysis of VHL Gene Alterations and their Relationship to Clinical Parameters in Sporadic Conventional Renal Cell Carcinoma. Clinical Cancer Research. 15 (24), 7582-7592 (2009).
- Gossage, L., Eisen, T., Maher, E. R. VHL, the story of a tumour suppressor gene. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 55-64 (2015).
- Sato, Y., et al. Integrated molecular analysis of clear-cell renal cell carcinoma. Nature Genetics. 45 (8), 860-867 (2013).
- Choueiri, T. K., et al. The role of aberrant VHL/HIF pathway elements in predicting clinical outcome to pazopanib therapy in patients with metastatic clear-cell renal cell carcinoma. Clinical Cancer Research. 19 (18), 5218-5226 (2013).
- Hsu, T. Complex cellular functions of the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene: insights from model organisms. Oncogene. 31 (18), 2247-2257 (2012).
- Albers, J., et al. Combined mutation of Vhl and Trp53 causes renal cysts and tumours in mice. EMBO Molecular Medicine. 5 (6), 949-964 (2013).
- Schokrpur, S., et al. CRISPR-Mediated VHL Knockout Generates an Improved Model for Metastatic Renal Cell Carcinoma. Scientific Reports. 6, 29032 (2016).
- Hu, J., et al. A Non-integrating Lentiviral Approach Overcomes Cas9-Induced Immune Rejection to Establish an Immunocompetent Metastatic Renal Cancer Model. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 9, 203-210 (2018).
- Heerboth, S., et al. EMT and tumor metastasis. Clinical and Translational Medicine. 4, 6 (2015).
- DeBord, L. C., et al. The chick chorioallantoic membrane (CAM) as a versatile patient-derived xenograft (PDX) platform for precision medicine and preclinical research. American Journal of Cancer Research. 8 (8), 1642-1660 (2018).
- Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (5), 1643-1648 (2005).
- Ribatti, D. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology. Experimental Cell Research. 328 (2), 314-324 (2014).
- Ismail, M. S., et al. Photodynamic Therapy of Malignant Ovarian Tumours Cultivated on CAM. Lasers in Medical Science. 14 (2), 91-96 (1999).
- Kaufman, N., Kinney, T. D., Mason, E. J., Prieto, L. C. Maintenance of human neoplasm on the chick chorioallantoic membrane. The American Journal of Pathology. 32 (2), 271-285 (1956).
- Janse, E. M., Jeurissen, S. H. Ontogeny and function of two non-lymphoid cell populations in the chicken embryo. Immunobiology. 182 (5), 472-481 (1991).
- Leene, W., Duyzings, M. J., van Steeg, C. Lymphoid stem cell identification in the developing thymus and bursa of Fabricius of the chick. Zeitschrift fur Zellforschung und Mikroskopische Anatomie. 136 (4), 521-533 (1973).
- Solomon, J. B. . Foetal and neonatal immunology (Frontiers of biology). 20, (1971).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Sterile Tissue Harvest. , (2019).
- Palmer, T. D., Lewis, J., Zijlstra, A. Quantitative analysis of cancer metastasis using an avian embryo model. Journal of Visualized Experiments. (51), e2815 (2011).
- Fergelot, P., et al. The experimental renal cell carcinoma model in the chick embryo. Angiogenesis. 16 (1), 181-194 (2013).
- Sharrow, A. C., Ishihara, M., Hu, J., Kim, I. H., Wu, L. Using the Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Study Gynecological and Urological Cancers. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Lőw, P., Molnár, K., Kriska, G. . Atlas of Animal Anatomy and Histology. , 265-324 (2016).
- Hu, J., Ishihara, M., Chin, A. I., Wu, L. Establishment of xenografts of urological cancers on chicken chorioallantoic membrane (CAM) to study metastasis. Precision Clinical Medicine. 2 (3), 140-151 (2019).
- Casar, B., et al. In vivo cleaved CDCP1 promotes early tumor dissemination via complexing with activated beta1 integrin and induction of FAK/PI3K/Akt motility signaling. Oncogene. 33 (2), 255-268 (2014).
