يوفر هذا البروتوكول للباحثين طريقه سريعة وغير مباشره لقياس نشاط عامل النسخ NF-кB/AP-1 المعتمد علي TLR في خط خلايا الضامة في الاستجابة لمجموعه متنوعة من الأسطح البوليمريه وطبقات البروتين الممتصة التي تقوم بنمذجة البيئة المجهرية للزرع.
استجابه المضيف التهابيه المستمرة للمواد البيولوجية المزروعة ، والمعروفة باسم رد فعل الجسم الأجنبي ، تمثل تحديا كبيرا في تطوير وتنفيذ الاجهزه الطبية الحيوية وتركيبات هندسه الانسجه. الضامة ، خليه مناعية فطريه ، هي اللاعبين الرئيسيين في رد فعل الجسم الأجنبي لأنها تبقي في موقع الزرع لعمر الجهاز ، وتدرس عاده للحصول علي فهم لهذه الاستجابة المضيف الضارة. وقد أظهرت العديد من الباحثين حيوي ان طبقات البروتين الممتد علي المواد المزروعة تؤثر علي سلوك الضامة ، وبعد ذلك تؤثر علي استجابه المضيف. تصف الطرق في هذه الورقة نموذجا في المختبر باستخدام طبقات البروتين الممتصة التي تحتوي علي جزيئات التلف الخلوي علي أسطح البوليمرات الحيوية لتقييم استجابات الضامة. تم استخدام NF-кB/AP-1 مراسل خط الخلايا الضامة والمقايسة الفوسفاتيز القلوية اللونية المرتبطة كطريقه سريعة لفحص غير مباشر NF-кB/AP-1 نشاط عامل النسخ استجابه لطبقات البروتين الممتدة المعقدة التي تحتوي علي بروتينات الدم والأنماط الجزيئية المرتبطة بالتلف ، كنموذج لطبقات البروتين الممتدة المعقدة التي تتشكل علي الأسطح الحيوية في الجسم الحيوي.
رد فعل الجسم الخارجي (FBR) هو استجابه المضيف المزمنة التي يمكن ان تؤثر سلبا علي أداء المواد المزروعة أو الجهاز (علي سبيل المثال ، أجهزه تسليم المخدرات ، والمواد البيولوجية) ، من خلال الإفراج المستمر من الوسطاء التهابيه وعرقله التكامل بين المادة المزروعةوالانسجه ال ويبدا هذا الاستجابة المناعية الفطرية من خلال اجراء الغرس ويتميز بوجود طويل الأمد للخلايا المناعية الفطرية وتشكيل كبسوله ليفية حول زرع1. في سياق الاستجابات المضيفة المادية ، والتفاعلات الضامة المادية لها تاثير كبير علي تطور استجابه المضيف وتطوير FBR1. الضامة هي مجموعه متنوعة من الخلايا المناعية الفطرية, المجندين في موقع الزرع اما من السكان الضامة الانسجه المقيمين أو من الدم كالضامة المشتقة من الخلايا الاحاديه. يبدؤون في التراكم في موقع الزرع بعد فتره وجيزة من الغرس ، وفي غضون أيام تصبح الخلايا المهيمنة في البيئة المجهرية المزروعة. المواد-الضامة ملتصقة ، جنبا إلى جنب مع خلايا الجسم العملاقة الاجنبيه (fbgc) شكلت من خلال الانصهار الضامة ، يمكن ان تستمر علي سطح المادة لعمر الزرع2،3. التالي, تعتبر الضامة لتكون اللاعبين الرئيسيين في استجابه الجسم الأجنبي بسبب أدوارهم تدبير الخطوات المميزة لل FBR: استجابه التهابيه حاده, أعاده عرض الانسجه, وتشكيل الانسجه الليفية1.
مستقبلات مثل الأرقام (TLRs) هي عائله من مستقبلات التعرف علي النمط التي يتم التعبير عنها من قبل العديد من الخلايا المناعية, بما في ذلك الضامة, وقد ثبت ان تلعب دورا هاما في التهاب والتئام الجروح. بالاضافه إلى العوامل المسببة للمرض ، TLRs قادره علي ربط الجزيئات الذاتية ، والمعروفة باسم الاضرار المرتبطة الأنماط الجزيئية (DAMPs) ، والتي يتم تحريرها اثناء نخر الخلية وتنشيط مسارات الإشارات التهابيه مما ادي إلى إنتاج السايتوكينات التهابيه4. وقد اقترحنا نحن والآخرين ان الضرر المتكبدة خلال الانسجه الرخوة الحيوية إجراءات الزرع الإفراج damps ، التي كثفت بعد ذلك إلى الأسطح الحيوية بالاضافه إلى بروتينات الدم وتعدل التفاعلات اللاحقة الخلية المادية5،6. عندما تتفاعل الضامة مع طبقه البروتين الممتص علي الزرع ، قد تتعرف علي سطحها TLRs تكثيف DAMPs وتنشيط السلاسل التعاقبية الإشارات التهابيه ، مما يؤدي إلى NF-κB و AP-1 عامل النسخ التنشيط وإنتاج السايتوكينات التهابيه. لقد أظهرنا سابقا ان الضامة murine قد زادت بشكل ملحوظ NF-κB/AP-1 النشاط وعامل نخر الورم α (TNF-α ، إفراز التهابات الخلوية) في الاستجابة لطبقات البروتين الممتزات التي تحتوي علي الرطوبة علي مجموعه متنوعة من الأسطح البوليمريه مقارنه بالأسطح مع مصل الممتزات أو البلازما فقط (اي ، لا يوجد DAMPs الحالية) ، وان هذا الرد توسط إلى حد كبير من قبل TLR2 ، في حين TLR4 يلعب دورا اقل5.
و nf-κb/AP-1 مراسل الضام خط الخلية (جدول المواد) المستخدمة في هذا البروتوكول هو وسيله مريحه لقياس النسبية NF-κb و AP-1 النشاط في الضامة5،7،8. في تركيبه مع مثبطات مسار tlr ، هذا الخط خليه أداه مفيده للتحقيق التنشيط tlr ودوره في التهاب استجابه لمجموعه متنوعة من المحفزات5،7،8. الخلايا المراسلة هي الماوس تعديل الضامة مثل خط الخلية التي يمكن ان تنتج بشكل ثابت يفرز الفوسفاتيز القلوية الجنينية (SEAP) علي NF-κB و AP-1 عامل النسخ تفعيل9. ويمكن بعد ذلك استخدام المقايسة الفوسفاتيزه القلوية الانزيميه الملونة (جدول المواد) لقياس الكميات النسبية للتعبير seap كمقياس غير مباشر للنشاط NF-κb/AP-1. كما NF-κB و AP-1 هي المصب من العديد من مسارات إشارات الخلية ، وتحييد الأجسام المضادة والمثبطات التي تستهدف TLRs محدده (علي سبيل المثال ، TLR2) أو الجزيئات محول TLRS (علي سبيل المثال ، MyD88) يمكن استخدامها للتحقق من دور مسار معين. توفر المنهجية الموصوفة في هذه المقالة نهجا بسيطا وسريعا لتقييم مساهمه الإشارات TLR في استجابات الضامة murine إلى مجموعه متنوعة من الأسطح البوليمريه مع طبقات البروتين الممتص التي تحتوي علي كل من بروتينات الدم و DAMPs كنموذج في المختبر من الحيوي المزروعة.
التركيز الأساسي لمعملنا هو استجابه المضيف لعمليات زراعه الانسجه الرخوة الصلبة ، وعلي وجه الخصوص كيف تؤثر الاضرار الخلوية المتكبدة اثناء اجراء الغرس علي استجابه المضيف. يصف العمل المعروض هنا التجارب الاوليه باستخدام خط خليه الضامة مراسل وفي المختبر الذي يحتوي علي الرطوبة الخلوية التي تح…
The authors have nothing to disclose.
ويعرب المؤلفون عن امتنانهم للتمويل التشغيلي من مشروع المعاهد الكندية للبحوث الصحية (PTJ 162251) ، ولجنه البحوث الاستشارية التابعة لمجلس الشيوخ بجامعه الملكة ، ودعم البنية التحتية من صندوق جون ايفان للقيادة التابع للمؤسسة الكندية للابتكار (34137 المشروع 34137). وقد دعمت L.A.M. من قبل جامعه الملكة r. صموئيل ماكلولين الزمالة ، والعلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث الكندية جائزه الماجستير في المنح الدراسية الدراسات العليا والدراسات العليا في اونتاريو. ويود المؤلفون ان يشكروا الدكتور ميرون سيتشووك علي هديته السخية من الخط الخلوي “NF-κB/AP-1” و “Drs”. مايكل بلينهاسيت وساندرا لورنزو لاستخدامها نظام التصوير هلام وقارئ لوحه.
Cell culture reagents | |||
anti-mouse/human CD282 (TLR2) | Biolegend | 121802 | |
CLI-095 (TLR4 inhibitor) | Invivogen | TLRL-CLI95 | |
C57 complement plasma K2 EDTA 10ml, innovative grade US origin | InnovativeResearch | IGMSC57-K2 EDTA-Compl-10ml | Mouse plasma |
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Sigma Aldrich | D6429-500ML | |
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Fisher Scientific | 14190250 | No calcium, no magnesium |
Fetal bovine serum (FBS), research grade | Wisent | 98150 | |
LPS-EK | Invivogen | TLRL-EKLPS | Lipopolysaccharide from Escherichia coli K12 |
NIH/3T3 fibroblasts | ATCC | CRL-1658 | |
Pam3CSK4 | Invivogen | tlrl-pms | Synthetic triacylated lipopeptide – TLR1/2 ligand |
Penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich | P4333-100ML | |
Plasmocin | Invivogen | ANT-MPP | Mycoplasma elimination reagent |
RAW-Blue cells | Invivogen | raw-sp | NF-κB/AP-1 reporter macrophage cell line |
Trypan blue solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15250061 | |
TrypLE express enzyme (1X) | Fisher Scientific | 12604021 | animal origin-free recombinant cell dissociation enzyme |
Zeocin | Invivogen | ANT-ZN-1 | |
Kits and assays | |||
ELISA precoated plates, mouse IL-6 | Biolegend | B213022 | |
ELISA precoated plates, mouse TNF-α | Biolegend | B220233 | |
Endotoxin (Escherichia coli) – Control standard endotoxin (CSE) | Associates of Cape Cope Inc. | E0005-5 | Endotoxin for standard curve in chromogenic endotoxin assay |
LAL water, 100 mL | Associates of Cape Cope Inc. | WP1001 | Used with chromogenic endotoxin assay |
Micro BCA protein assay | Fisher Scientific | PI23235 | |
Limulus amebocyte lysate (LAL) Pyrochrome endotoxin test kit | Associates of Cape Cope Inc. | C1500-5 | Chromogenic endotoxin assay reagent |
QUANTI-Blue alkaline phosphatase detection medium | Invivogen | rep-qb2 | Alkaline phosphatase assay to indirectly measure NF-κB/AP-1 activity |
Polymeric coating reagents | |||
Chloroform, anhydrous | Sigma Aldrich | 288306-1L | |
Ethyl alcohol anhydrous | Commercial Alcohols | P006EAAN | Sigma: Reagent alcohol, anhydrous, 676829-1L |
Straight tapered fine tip forceps | Fisher Scientific | 16-100-113 | |
Fluorinert FC-40 solvent | Sigma Aldrich | F9755-100ML | Fluorinated solvent for fPTFE |
Cell culture grade water (endotoxin-free) | Fisher Scientific | SH30529LS | |
Poly(methyl methacrylate) (PMMA) | Sigma Aldrich | 182230-25G | |
Sylgard 184 elastomer kit | Fisher Scientific | 50822180 | |
Teflon-AF (fPTFE) | Sigma Aldrich | 469610-1G | Poly[4,5-difluoro-2,2-bis(trifluoromethyl)-1,3-dioxole-co-tetrafluoroethylene] |
Consumables | |||
Adhesive plate seals | Fisher Scientific | AB-0580 | |
Axygen microtubes, 1.5 mL | Fisher Scientific | 14-222-155 | |
Borosilicate glass scintillation vials, with white polypropylene caps | Fisher Scientific | 03-337-4 | |
Clear PS 48-well plate | Fisher Scientific | 08-772-52 | |
Clear TCPS 96-well plate | Fisher Scientific | 08-772-2C | |
Clear TCPS 48-well plate | Fisher Scientific | 08-772-1C | |
Cover glasses, circles | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
Falcon tissue culture treated flasks, T25 | Fisher Scientific | 10-126-10 | |
sticky-Slide 8 Well | Ibidi | 80828 | |
Superfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Tissue culture treated flasks, T150 | Fisher Scientific | 08-772-48 |