Dit protocol biedt onderzoekers een snelle, indirecte methode voor het meten van TLR-afhankelijke NF-кB/AP-1 transcriptiefactor-activiteit in een muriene macrofaag cellijn in reactie op een verscheidenheid aan polymere oppervlakken en geadsorbeende eiwit lagen die de micro omgeving van het biomateriaal implantaat modelleren.
De aanhoudende inflammatoire gastheer reactie op een geïmplanteerd biomateriaal, bekend als de reactie van het vreemde lichaam, is een belangrijke uitdaging in de ontwikkeling en implementatie van biomedische apparaten en weefsel engineering constructies. Macrofagen, een aangeboren immuuncel, zijn belangrijke spelers in de reactie van het vreemde lichaam omdat ze op de implantatieplaats blijven gedurende de levensduur van het apparaat, en worden vaak bestudeerd om een goed begrip te krijgen van deze nadelige reactie van de gastheer. Veel biomaterialen onderzoekers hebben aangetoond dat geadsorlageerde proteïne lagen op geïmplanteerde materialen het macrofaag gedrag beïnvloeden en vervolgens invloed hebben op de reactie van de gastheer. De methoden in dit artikel beschrijven een in vitro model met behulp van geadsorpete eiwit lagen met cellulaire schade moleculen op polymeer biomateriaal oppervlakken om macrofaag reacties te beoordelen. Een NF-кb/AP-1 reporter macrofaag cellijn en de bijbehorende colorimetrische alkalische fosfatase assay werden gebruikt als een snelle methode om indirect te onderzoeken NF-кb/AP-1 transcriptiefactor activiteit in reactie op complexe geadsorbeerden eiwit lagen met bloed eiwitten en schade-geassocieerde moleculaire patronen, als model van de complexe geadsorreven proteïne lagen gevormd op biomateriaal oppervlakken in vivo.
De reactie van het vreemde lichaam (FBR) is een chronische reactie van de gastheer die een negatieve invloed kan hebben op de prestaties van een geïmplanteerd materiaal of apparaat (bijv. medicatie bezorgings apparatuur, biosensoren), door de aanhoudende afgifte van ontstekingsmediatoren en door het belemmeren van de integratie tussen het geïmplanteerde materiaal en het omringende weefsel1. Deze aangeboren immuunrespons wordt geïnitieerd door de implantatie procedure en wordt gekenmerkt door de langdurige aanwezigheid van aangeboren immuuncellen en vezelig capsule vorming rond het implantaat1. Binnen de context van materiële gastheer reacties, macrofaag-materiaal interacties hebben een aanzienlijke invloed op de progressie van de reactie van de gastheer en de ontwikkeling van een FBR1. Macrofagen zijn een gevarieerde aangeboren immuuncelpopulatie, die wordt gerekruteerd op de implantatieplaats, hetzij van weefsel-Resident macrofaag populaties of van het bloed als monoyte-afgeleide macrofagen. Ze beginnen zich op de implantatieplaats te accumuleren kort na de inplanting en worden binnen enkele dagen de overheersende celpopulatie in de micro omgeving van het implantaat. Materiaal aanhechting macrofagen, samen met vreemde lichaam reuscellen (fbgc) gevormd door macrofaag fusie, kan aanhouden op het materiële oppervlak voor de levensduur van het implantaat2,3. Bijgevolg worden macrofagen beschouwd als belangrijke spelers in de reactie van het buitenlandse lichaam als gevolg van hun rollen die de karakteristieke stappen van de FBR indelen: acute inflammatoire respons, weefsel remodellering, en vorming van fibrotische weefsel1.
Toll-achtige receptoren (TLRs) zijn een familie van patroon erkenning receptoren die worden uitgedrukt door vele immuuncellen, met inbegrip van macrofagen, en is aangetoond dat het spelen van een belangrijke rol bij ontsteking en wondgenezing. Naast pathogenen afgeleide liganden, kunnen Tlr’s endogene moleculen binden, bekend als schade-geassocieerde moleculaire patronen (DAMPs), die vrijkomen tijdens celnecrose en ontstekings signalerings trajecten activeren, resulterend in de productie van proinflammatoire cytokines4. Wij en anderen hebben voorgesteld dat schade die is opgelopen tijdens implantatie procedures voor zacht weefsel biomateriaal, de Damps, die vervolgens worden geadsord aan biomateriale oppervlakken in aanvulling op bloed proteïnen, en de daaropvolgende celmateriaalinteracties met een moduleren van5,6. Wanneer macrofagen interactie met de geadsorbende proteïne-laag op een implantaat, hun oppervlak TLRs kunnen geadsorberen DAMPs herkennen en activeren proinflammatoire signalering Cascades, wat leidt tot NF-κB en AP-1 transcriptiefactor activering en productie van proinflammatoire cytokines. We hebben eerder aangetoond dat Murine macrofagen significant hebben verhoogd NF-κB/AP-1 activiteit en tumor necrose factor α (TNF-α, proinflammatoire cytokine) secretie in reactie op vocht bevattende geadsorbeerde eiwit lagen op verschillende polymere oppervlakken in vergelijking met oppervlakken met geadsorbeerd serum of plasma (d.w.z. geen DAMPs aanwezig), en dat deze respons grotendeels wordt gemedieerd door TLR2, terwijl TLR4 een mindere rol speelt5.
De NF-κb/AP-1 reporter macrofaag cellijn (tabel met materialen) gebruikt in dit protocol is een handige methode voor het meten van relatieve NF-κb en AP-1 activiteit in macrofagen5,7,8. In combinatie met TLR-pathway-remmers is deze cellijn een nuttig hulpmiddel voor het onderzoeken van TLR-activering en zijn rol in ontsteking als reactie op een verscheidenheid aan stimuli5,7,8. De reporter cellen zijn een gemodificeerde muis macrophage-achtige cellijn die stabiel kan produceren uitgescheiden embryonale alkalische fosfatase (SEAP) op NF-κB en AP-1 transcriptiefactor activering9. De colorimetrische enzymatische alkalische fosfatase assay (tabel met materialen) kan vervolgens worden gebruikt om relatieve hoeveelheden seap-expressie te kwantificeren als indirecte maatstaf van NF-κb/AP-1-activiteit. Omdat NF-κB en AP-1 stroomafwaarts liggen van veel cel signalerings trajecten, kunnen neutraliserende antilichamen en remmers die gericht zijn op specifieke Tlr’s (bijv. TLR2) of TLR-adapter moleculen (bijvoorbeeld MyD88) worden gebruikt om de rol van een specifiek traject te controleren. De in dit artikel beschreven methodologie biedt een eenvoudige en snelle benadering voor het beoordelen van de bijdrage van TLR-signalering in muriene macrofaag responsen op een verscheidenheid aan polymere oppervlakken met geadsorlageerde proteïne lagen die zowel bloed eiwitten als DAMPs bevatten als een in vitro model van geïmplanteerde biomaterialen.
Een primaire focus van ons lab is de gastheer reactie op solide biomateriaal weke delen implantaten, en in het bijzonder hoe de cellulaire schade opgelopen tijdens de implantatie procedure invloed op de reactie van de gastheer. Het hier gepresenteerde werk beschrijft voorbereidende experimenten met behulp van een verslaggever macrofaag cellijn en in vitro-gegenereerd vocht-bevattende cellulair lysaat, om de invloed te onderzoeken van moleculen die vrijkomen tijdens cellulaire schade (d.w.z. van de implantatie operatie) o…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs erkennen de operationele financiering van Canadian Institutes of Health Research project (PTJ 162251), Queen’s University Senate Advisory Research Committee en Infrastructure support van de Canadian Foundation for Innovation John Evan’s Leadership Fund (project 34137) en het Ontario Research Fund van het ministerie van onderzoek en innovatie (project 34137). L.A.M. werd gesteund door een Queen’s University R. Samuel McLaughlin Fellowship, een natuurwetenschappen en ingenieurs Onderzoekraad van Canada Canadian Graduate beurs Master’s Award en een Ontario Graduate beurs. De auteurs willen Dr. Myron szewczuk bedanken voor zijn genereuze gave van de NF-κb/AP-1 reporter macrofaag Cell line en Drs. Michael Blennerhassett en Sandra lourenssen voor het gebruik van hun gel Imaging systeem en Plate Reader.
Cell culture reagents | |||
anti-mouse/human CD282 (TLR2) | Biolegend | 121802 | |
CLI-095 (TLR4 inhibitor) | Invivogen | TLRL-CLI95 | |
C57 complement plasma K2 EDTA 10ml, innovative grade US origin | InnovativeResearch | IGMSC57-K2 EDTA-Compl-10ml | Mouse plasma |
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Sigma Aldrich | D6429-500ML | |
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Fisher Scientific | 14190250 | No calcium, no magnesium |
Fetal bovine serum (FBS), research grade | Wisent | 98150 | |
LPS-EK | Invivogen | TLRL-EKLPS | Lipopolysaccharide from Escherichia coli K12 |
NIH/3T3 fibroblasts | ATCC | CRL-1658 | |
Pam3CSK4 | Invivogen | tlrl-pms | Synthetic triacylated lipopeptide – TLR1/2 ligand |
Penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich | P4333-100ML | |
Plasmocin | Invivogen | ANT-MPP | Mycoplasma elimination reagent |
RAW-Blue cells | Invivogen | raw-sp | NF-κB/AP-1 reporter macrophage cell line |
Trypan blue solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15250061 | |
TrypLE express enzyme (1X) | Fisher Scientific | 12604021 | animal origin-free recombinant cell dissociation enzyme |
Zeocin | Invivogen | ANT-ZN-1 | |
Kits and assays | |||
ELISA precoated plates, mouse IL-6 | Biolegend | B213022 | |
ELISA precoated plates, mouse TNF-α | Biolegend | B220233 | |
Endotoxin (Escherichia coli) – Control standard endotoxin (CSE) | Associates of Cape Cope Inc. | E0005-5 | Endotoxin for standard curve in chromogenic endotoxin assay |
LAL water, 100 mL | Associates of Cape Cope Inc. | WP1001 | Used with chromogenic endotoxin assay |
Micro BCA protein assay | Fisher Scientific | PI23235 | |
Limulus amebocyte lysate (LAL) Pyrochrome endotoxin test kit | Associates of Cape Cope Inc. | C1500-5 | Chromogenic endotoxin assay reagent |
QUANTI-Blue alkaline phosphatase detection medium | Invivogen | rep-qb2 | Alkaline phosphatase assay to indirectly measure NF-κB/AP-1 activity |
Polymeric coating reagents | |||
Chloroform, anhydrous | Sigma Aldrich | 288306-1L | |
Ethyl alcohol anhydrous | Commercial Alcohols | P006EAAN | Sigma: Reagent alcohol, anhydrous, 676829-1L |
Straight tapered fine tip forceps | Fisher Scientific | 16-100-113 | |
Fluorinert FC-40 solvent | Sigma Aldrich | F9755-100ML | Fluorinated solvent for fPTFE |
Cell culture grade water (endotoxin-free) | Fisher Scientific | SH30529LS | |
Poly(methyl methacrylate) (PMMA) | Sigma Aldrich | 182230-25G | |
Sylgard 184 elastomer kit | Fisher Scientific | 50822180 | |
Teflon-AF (fPTFE) | Sigma Aldrich | 469610-1G | Poly[4,5-difluoro-2,2-bis(trifluoromethyl)-1,3-dioxole-co-tetrafluoroethylene] |
Consumables | |||
Adhesive plate seals | Fisher Scientific | AB-0580 | |
Axygen microtubes, 1.5 mL | Fisher Scientific | 14-222-155 | |
Borosilicate glass scintillation vials, with white polypropylene caps | Fisher Scientific | 03-337-4 | |
Clear PS 48-well plate | Fisher Scientific | 08-772-52 | |
Clear TCPS 96-well plate | Fisher Scientific | 08-772-2C | |
Clear TCPS 48-well plate | Fisher Scientific | 08-772-1C | |
Cover glasses, circles | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
Falcon tissue culture treated flasks, T25 | Fisher Scientific | 10-126-10 | |
sticky-Slide 8 Well | Ibidi | 80828 | |
Superfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Tissue culture treated flasks, T150 | Fisher Scientific | 08-772-48 |