Isolierung und Charakterisierung von patientenabgeleiteten Pankreas-Ductal Adenokarzinom-Organoidmodellen

Summary

Patientenabgeleitete organoide Kulturen des pankreatischen duktodalen Adenokarzinoms sind ein schnell etabliertes dreidimensionales Modell, das epitheliale Tumorzellkompartimente mit hoher Genauigkeit darstellt und translationale Forschung entoliert. Hier bieten wir detaillierte Methoden zur Etablierung und Vermehrung von Organoiden sowie zur Durchführung relevanter biologischer Assays mit diesen Modellen.

Abstract

Pankreas-Duktodas-Adenokarzinom (PDAC) gehört zu den tödlichsten Malignitäten. Kürzlich wurden Organoidkulturmethoden der nächsten Generation beschrieben, die die dreidimensionale (3D) Modellierung dieser Krankheit ermöglichen. Patientenabgeleitete Organoidmodelle (g.U.) können sowohl aus chirurgischen Proben als auch aus kleinen Biopsien isoliert werden und sich schnell in der Kultur bilden. Wichtig ist, dass Organoidmodelle die pathogenen genetischen Veränderungen, die im Tumor des Patienten festgestellt wurden, erhalten und die Behandlungsreaktion des Patienten vorhersagen und so translationale Studien ermöglichen. Hier bieten wir umfassende Protokolle zur Anpassung des Gewebekultur-Workflows zur Untersuchung von 3D-, Matrix-Eingebetteten, Organoidmodellen. Wir beschreiben Methoden und Überlegungen zur Isolierung und Verbreitung primärer PDAC-Organoide. Darüber hinaus beschreiben wir, wie maßgeschneiderte organoide Medien im Labor hergestellt und qualitätskontrolliert werden. Schließlich beschreiben wir Assays zur nachgelagerten Charakterisierung der Organoidmodelle wie Isolierung von Nukleinsäuren (DNA und RNA) und Arzneimitteltests. Wichtig ist, dass wir kritische Überlegungen für die Implementierung der organoiden Methodik in einem Forschungslabor liefern.

Introduction

Pankreas-Duktodas-Adenokarzinom (PDAC) ist eine tödliche Erkrankung, die durch eine späte Diagnose bei den meisten Patienten, einen Mangel an wirksamen Therapien und eine daraus resultierende niedrige 5-Jahres-Gesamtüberlebensrate gekennzeichnet ist, die unter 10%¹bleibt. Nur 20% der Patienten werden mit einer lokalisierten Krankheit diagnostiziert, die für den kurativen chirurgischen Eingriff geeignet ist^2,3. Die übrigen Patienten werden in der Regel mit einer Kombination von Chemotherapeutika behandelt, die bei einer Minderheit der Patienten wirksam sind^4,5. Um diesen dringenden klinischen Bedürfnissen gerecht zu werden, arbeiten die Forscher aktiv an Früherkennungsstrategien und der Entwicklung wirksamerer Therapien. Um die klinische Übersetzung wichtiger Entdeckungen zu beschleunigen, verwenden Wissenschaftler gentechnisch veränderte Mausmodelle, von Patienten abgeleitete Xenografts, monolayer Zelllinien und zuletzt Organoidmodelle⁶.

Dreidimensionale epitheliale Organoidkultur mit Wachstumsfaktor und Wnt-Ligand-reichen Bedingungen zur Stimulierung der Proliferation von untransformierten Vorläuferzellen wurden zuerst für den Mausdarm^{beschrieben 7} und wurden schnell an normales menschliches Bauchspeicheldrüsengewebe angepasst⁸. Zusätzlich zu normalen duktalen Gewebe, Organoid-Methodik ermöglicht die Isolierung, Expansion, und Studie des menschlichen PDAC⁸. Wichtig ist, dass die Methode die Etablierung von Organoiden aus chirurgischen Proben sowie Feine und Kernnadelbiopsien unterstützt, so dass Forscher alle Stadien der Krankheit^9,10untersuchen können. Interessanterweise rekapitulieren patientenabgeleitete Organoide gut beschriebene Tumortranskriptomik-Subtypen und können die Entwicklung von Präzisionsmedizinplattformen^9,11ermöglichen.

Aktuelle Organoidprotokolle für PDAC ermöglichen die erfolgreiche Erweiterung von mehr als 70% der Patientenproben von chemonaiven Patienten⁹. Hier stellen wir die Standardmethoden unseres Labors zur Isolierung, Erweiterung und Charakterisierung von patientenabgeleiteten PDAC-Organoiden vor. Andere ORGANoide PDAC-Methoden wurden beschrieben^12,13 aber es wurde kein Vergleich dieser Methode durchgeführt. Da diese Technologie relativ neu ist und schnell voranschreitet, erwarten wir, dass sich diese Protokolle weiterentwickeln und verbessern werden; die Prinzipien der Gewebehandhabung und der organoiden Kultur werden jedoch weiterhin nützlich sein.

Protocol

Alle menschlichen Gewebesammlungen für forschungstechnische Verwendung wurden von unserem Internal Review Board (IRB) überprüft und genehmigt. Alle folgenden Protokolle werden unter aseptischen Bedingungen in einer Laborumgebung für Säugetiergewebekultur durchgeführt. 1. Medienvorbereitung Konditionierte Medienvorbereitung.HINWEIS: Die menschlichen Pankreasorganoid-Medien erfordert reichlich Wachstumsfaktoren und Nährstoffe sowie konditionierte Mediensupplementierung, um a…

Representative Results

Um die Herausforderungen zu veranschaulichen, die mit der Isolierung von Organoiden aus PDAC verbunden sind, zeigen wir die Etablierung einer patientenabgeleiteten Organoidkultur aus einer kleinen hypozellulären Tumorprobe. Nach der ersten Beschichtung waren nur wenige Organoide pro Brunnen sichtbar, wie in Abbildung 1dargestellt. Organoide durften über einen Zeitraum von 2 Wochen größer werden und wurden gemäß unserem Protokoll durchdrungen, um eine robustere Kultur zu etablieren, wie…

Discussion

Hier stellen wir aktuelle Protokolle zur Isolierung, Erweiterung und Charakterisierung von patientenabgeleiteten PDAC-Organoiden vor. Unsere derzeitige Erfolgsquote bei der Etablierung einer organoiden Kultur liegt bei über 70 %; daher sind diese Methoden noch nicht perfektioniert und werden sich im Laufe der Zeit verbessern und weiterentwickeln. Die Stichprobengröße sollte in Betracht gezogen werden, da PDAC eine geringe neoplastische Zellulizität hat. Folglich enthalten kleine Proben nur wenige Tumorzellen und erze…

Materials

12 channel pipette (p20, p100, or p200) with tips
12 well plates	Olympus	25-106
15 ml LoBind conical tubes	Eppendorf	EP0030122208
15 ml tube Rotator and/or nutator
37 °C CO2 incubator
37 °C water bath
384 well plates	Corning	4588	Ultra low attachment, black and optically clear
A 83-01	TOCRIS	2939
ADV DMEM	ThermoFisher	12634010
Animal-Free Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15
Automated cell counter
B27 supplement	ThermoFisher	17504044
Cell Recovery Solution	Corning	354253	Reagent that depolymerizes the Basement Membrane Extract at 4 °C
CellTiterGlow	Promega	G7570	Luminescence cell viability reagent
Chloroform	Sigma	C2432
Computer
CryoStor CS10	StemCELL Tech	07930	Cell Freezing Solution
Cultrex R-spondin1 (Rspo1) Cells	Trevigen	3710-001-K
DMEM	ATCC	30-2002
DNase I	Sigma	D5025
Drug printer	Tecan	D300e	This is the drug printer we use in our laboratory
Excel			For data analysis
Extra Fine Graefe Forceps	Fine Science Tools	11150-10
FBS	ThermoFisher	16000044
G-418	ThermoFisher	10131035
Gastrin I (human)	TOCRIS	3006
Gentle Collagenase/hyaluronidase	STEMCELL Tech	7919
GlutaMAX	ThermoFisher	35050061	Glutamine solution
GraphPad Prism			For data analysis
HEPES	ThermoFisher	15140122
Laminar flow tissue culture hood
Luminometer
L-Wnt-3A expressing cells	ATCC	CRL-2647
MACS Tissue Storage Solution	Miltenyi biotec	130-100-008
Matrigel Matrix	Corning	356230	Basement Membrane Extract (BME), growth factor reduced
Mr. Frosty Freezing Container	ThermoFisher	5100-0001
N-Acetylcysteine	Sigma	A9165
Nicotinamide	Sigma	N0636
p1000 pipette with tips
p200 pipette with tips
PBS	ThermoFisher	10010049
Penicillin/Streptomycin	ThermoFisher	15630080
primocin	InvivoGen	ant-pm-2
Rapid-Flow Filter Units (0.2 µm)	ThermoFisher	121-0020
Recombinant Human FGF-10	Peprotech	100-26
Recombinant Murine Noggin	Peprotech	250-38
Sterile Disposable Scalpels, #10 Blade	VWR	89176-380
Tissue culture centrifuge
Tissue Culture Dishes 10 cm	Olympus	25-202
TRIZol	ThermoFisher	15596018	Acid Phenol solution
TrypLE Express	ThermoFisher	12605010
Y-27632	Sigma	Y0503
Zeocin	ThermoFisher	R25001