Hasta Kaynaklı Pankreas Duktal Adenokarsinom Organoid Modellerinin İzolasyon ve Karakterizasyonu
Summary
Pankreas duktal adenokarsinomun hasta kaynaklı organoid kültürleri, epitel aliskan kollektifini yüksek sadakatle temsil eden, bu öldürücü maligniteye çeviri araþtirici araþtýrýmý saýkan, hýzlýklý bir 3 boyutlu modeldir. Burada organoidlerin kurulması ve yayılması ve bu modelleri kullanarak ilgili biyolojik tahlillerin gerçekleþtirilen ayrýntýlý yöntemlerin yer alýnmasýný saýlýyor.
Abstract
Pankreas duktal adenokarsinom (PDAC) en ölümcül maligniteler arasında yer alan. Son zamanlarda bu hastalığın 3 boyutlu (3D) modellemesini sağlayan yeni nesil organoid kültür yöntemleri tanımlanmıştır. Hasta kaynaklı organoid (PDO) modelleri hem cerrahi örneklerden hem de küçük biyopsilerden izole edilebilir ve kültürde hızla oluşabilir. Daha da önemlisi, organoid modeller hastanın tümöründe saptanan patojenik genetik değişiklikleri korur ve hastanın tedavi yanıtının öngörücül olduğunu, böylece çeviri çalışmalarının sağlanmasını sağlar. Burada, doku kültürü iş akışını 3D, matris gömülü, organoid modelleri çalışmaya uyarlamak için kapsamlı protokoller salıyoruz. Primer PDAC organoidlerinin izole edilmesi ve yayılması için yöntemleri ve dikkatleri ayrıntılı olarak anlatıyoruz. Ayrıca, ısmarlama organoid ortamın nasıl hazırlandığı ve laboratuvarda kalitenin nasıl kontrol altına alınabildiğini anlatıyoruz. Son olarak, nükleik asitlerin (DNA ve RNA) izolasyonu ve ilaç testi gibi organoid modellerin aşağı karakterizasyonu için tahliller açıklıyoruz. Daha da önemlisi, bir araştırma laboratuvarında organoid metodolojinin uygulanması için kritik hususlar ı savuruyoruz.
Introduction
Pankreas duktal adenokarsinom (PDAC) çoğu hastada geç tanı ile karakterize ölümcül bir hastalıktır, etkili tedavilerin eksikliği, ve daha az kalır sonuç olarak düşük 5 yıllık genel sağkalım oranı 10%1. Hastaların sadece %20’si küratif cerrahi girişime uygun lokalize bir hastalık tanısı konur2,3. Kalan hastalar genellikle hastaların bir azınlık etkili olan kemoterapötik ajanların bir kombinasyonu ile tedavi edilir4,5. Bu acil klinik ihtiyaçları karşılamak için, araştırmacılar aktif erken teşhis stratejileri ve daha etkili tedavilerin geliştirilmesi üzerinde çalışıyoruz. Önemli keşiflerin klinik çevirisini hızlandırmak için, bilim adamları genetiği değiştirilmiş fare modelleri, hasta türetilen ksenogreftler, monolayer hücre hatları ve en son organoid modelleri6istihdam ediyoruz.
Üç boyutlu epitel organoid kültür büyüme faktörü ve Wnt-ligand zengin koşulları kullanarak dönüştürülmemiş progenitor hücrelerinin çoğalmasını teşvik etmek için ilk fare bağırsağı için tarif edildi7 ve hızlı bir şekilde normal insan pankreasdokusunaadapte edildi 8 . Normal duktal dokuek olarak, organoid metodoloji izolasyon, genişleme sağlar, ve insan PDAC çalışma8. Daha da önemlisi, yöntem cerrahi örneklerden organoidlerin kurulmasını destekler, yanı sıra ince ve çekirdek iğne biyopsileri, araştırmacılar hastalığın tüm aşamalarında çalışma sağlayan9,10. İlginçtir, hasta kaynaklı organoidler iyi tanımlanmış tümör transkriptomik alt tipleri recapitulate ve hassas tıp platformları geliştirilmesini sağlayabilir9,11.
PDAC için mevcut organoid protokoller kemo-naif hastalardan alınan hasta örneklerinin %70’inden fazlasının başarılı bir şekilde genişlemesini sağlar9. Burada hasta kaynaklı PDAC organoidlerini izole etmek, genişletmek ve karakterize etmek için laboratuvarımız tarafından kullanılan standart yöntemleri salıyoruz. Diğer PDAC organoid metodolojileri12,13 tanımlanmıştır ancak bu yöntemin karşılaştırması tam olarak gerçekleştirilmiştir. Bu teknoloji nispeten yeni ve hızla ilerlerken, bu protokollerin gelişmeye ve gelişmeye devam etmesini bekliyoruz; ancak doku işleme ve organoid kültür ilkeleri yararlı olmaya devam edecektir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, hasta kaynaklı PDAC organoidlerinin izole, genişletme ve karakterizasyonu için mevcut protokolleri sıyoruz. Organoid kültürü oluşturmadaki mevcut başarı oranımız %70’in üzerindedir; bu nedenle, bu yöntemler henüz mükemmel olmamıştır ve geliştirmek ve zaman içinde gelişmeye bekleniyor. PDAC düşük neoplastik hücreselliğe sahip olduğu için örnek boyutuna önemli önem verilmelidir. Sonuç olarak, küçük örnekler birkaç tümör hücresi içerecek ve sadece bir avuç organoid üretece…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz UC San Diego Moores Kanser Merkezi Biyorepozitory ve Doku Teknolojisi Paylaşılan Kaynak, Lowy laboratuvar üyeleri ve UC San Diego Cerrahi Bölümü, Cerrahi Onkoloji Bölümü desteği için minnettarız. AML cömertçe NIH CA155620, bir SU2C CRUK Lustgarten Vakfı Pankreas Kanseri Dream Team Ödülü (SU2C-AACR-DT-20-16) tarafından desteklenir ve Fon Için Bağış Pankreas Kanseri Cure için.
Materials
| 12 channel pipette (p20, p100, or p200) with tips | |||
| 12 well plates | Olympus | 25-106 | |
| 15 ml LoBind conical tubes | Eppendorf | EP0030122208 | |
| 15 ml tube Rotator and/or nutator | |||
| 37 °C CO2 incubator | |||
| 37 °C water bath | |||
| 384 well plates | Corning | 4588 | Ultra low attachment, black and optically clear |
| A 83-01 | TOCRIS | 2939 | |
| ADV DMEM | ThermoFisher | 12634010 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Automated cell counter | |||
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Reagent that depolymerizes the Basement Membrane Extract at 4 °C |
| CellTiterGlow | Promega | G7570 | Luminescence cell viability reagent |
| Chloroform | Sigma | C2432 | |
| Computer | |||
| CryoStor CS10 | StemCELL Tech | 07930 | Cell Freezing Solution |
| Cultrex R-spondin1 (Rspo1) Cells | Trevigen | 3710-001-K | |
| DMEM | ATCC | 30-2002 | |
| DNase I | Sigma | D5025 | |
| Drug printer | Tecan | D300e | This is the drug printer we use in our laboratory |
| Excel | For data analysis | ||
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | |
| FBS | ThermoFisher | 16000044 | |
| G-418 | ThermoFisher | 10131035 | |
| Gastrin I (human) | TOCRIS | 3006 | |
| Gentle Collagenase/hyaluronidase | STEMCELL Tech | 7919 | |
| GlutaMAX | ThermoFisher | 35050061 | Glutamine solution |
| GraphPad Prism | For data analysis | ||
| HEPES | ThermoFisher | 15140122 | |
| Laminar flow tissue culture hood | |||
| Luminometer | |||
| L-Wnt-3A expressing cells | ATCC | CRL-2647 | |
| MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi biotec | 130-100-008 | |
| Matrigel Matrix | Corning | 356230 | Basement Membrane Extract (BME), growth factor reduced |
| Mr. Frosty Freezing Container | ThermoFisher | 5100-0001 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| p1000 pipette with tips | |||
| p200 pipette with tips | |||
| PBS | ThermoFisher | 10010049 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher | 15630080 | |
| primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | |
| Rapid-Flow Filter Units (0.2 µm) | ThermoFisher | 121-0020 | |
| Recombinant Human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | |
| Sterile Disposable Scalpels, #10 Blade | VWR | 89176-380 | |
| Tissue culture centrifuge | |||
| Tissue Culture Dishes 10 cm | Olympus | 25-202 | |
| TRIZol | ThermoFisher | 15596018 | Acid Phenol solution |
| TrypLE Express | ThermoFisher | 12605010 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | |
| Zeocin | ThermoFisher | R25001 |
Riferimenti
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
- Khorana, A. A., Mangu, P. B., Katz, M. H. G. Potentially Curable Pancreatic Cancer: American Society of Clinical Oncology Clinical Practice Guideline Update Summary. Journal of Oncology Practice. 13 (6), 388-391 (2017).
- Winter, J. M., et al. 1423 pancreaticoduodenectomies for pancreatic cancer: A single-institution experience. Journal of Gastrointestinal Surgery. 10 (9), 1210-1211 (2006).
- Von Hoff, D. D., et al. Increased survival in pancreatic cancer with nab-paclitaxel plus gemcitabine. New England Journal of Medicine. 369 (18), 1691-1703 (2013).
- Conroy, T., et al. FOLFIRINOX versus gemcitabine for metastatic pancreatic cancer. New England Journal of Medicine. 364 (19), 1817-1825 (2011).
- Baker, L. A., Tiriac, H., Clevers, H., Tuveson, D. A. Modeling pancreatic cancer with organoids. Trends in Cancer. 2 (4), 176-190 (2016).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Tiriac, H., et al. Organoid Profiling Identifies Common Responders to Chemotherapy in Pancreatic Cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
- Tiriac, H., et al. Successful creation of pancreatic cancer organoids by means of EUS-guided fine-needle biopsy sampling for personalized cancer treatment. Gastrointestinal Endoscopy. , (2018).
- Seino, T., et al. Human Pancreatic Tumor Organoids Reveal Loss of Stem Cell Niche Factor Dependence during Disease Progression. Cell Stem Cell. 22 (3), 454-467 (2018).
- Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
- Walsh, A. J., Castellanos, J. A., Nagathihalli, N. S., Merchant, N. B., Skala, M. C. Optical Imaging of Drug-Induced Metabolism Changes in Murine and Human Pancreatic Cancer Organoids Reveals Heterogeneous Drug Response. Pancreas. 45 (6), 863-869 (2016).
- Zhao, C. Wnt Reporter Activity Assay. Bio-Protocol. 4 (14), 1183 (2014).
- Conroy, T., et al. FOLFIRINOX or Gemcitabine as Adjuvant Therapy for Pancreatic Cancer. New England Journal of Medicine. 379 (25), 2395-2406 (2018).
- Jimeno, A., et al. A direct pancreatic cancer xenograft model as a platform for cancer stem cell therapeutic development. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (2), 310-314 (2009).
- Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
