تصنيع وتنفيذ منصة المجهر قوه السحب المرجعية الحرة

Summary

يوفر هذا البروتوكول إرشادات لتنفيذ الطباعة الحجرية متعددة الفوتونات لصنع صفائف ثلاثية الابعاد من علامات الإيماني الفلورية المضمنة في الهلام المائي القائم علي البولي إيثيلين غليكول لاستخدامه كاشاره خاليه ، مجهر قوه الجر منصات. باستخدام هذه التعليمات ، يتم تبسيط قياس السلالة المادية ثلاثية الابعاد وحساب عمليات التعقب الخلوية لتعزيز قياسات قوه الجر عاليه الانتاجيه.

Abstract

يوفر القياس الكمي لتشوه المواد الناتج عن الخلايا معلومات مفيده تتعلق بكيفية تحسس الخلايا والاستجابة للخصائص الفيزيائية لبيئتها الصغرى. في حين توجد العديد من النهج لقياس السلالة المادية التي يسببها الخلايا ، وهنا نقدم منهجيه لرصد الضغط مع القرار الفرعي ميكرون بطريقه خاليه من الإشارات. باستخدام عمليه الزخرفة الضوئية المنشطة ثنائيه الفوتون ، فاننا نثبت كيفيه توليد ركائز تركيبيه قابله للتوقد ميكانيكيا وحيويا والتي تحتوي علي صفائف مدمجه من علامات ايماني الفلورسنت لقياس ثلاثي الابعاد بسهوله ( 3D) ملامح تشوه المواد استجابه لtractions السطح. باستخدام هذه الركائز ، يمكن تعيين ملفات تعريف توتر الخلية باستخدام كومه صور ثلاثية الابعاد واحده لخليه ذات اهتمام. هدفنا مع هذه المنهجية هو جعل المجهر قوه الجر أكثر سهوله وأسهل لتنفيذ أداه للباحثين دراسة عمليات الميكنة الخلوية ، وخاصه الوافدين الجدد إلى الميدان.

Introduction

المجهر قوه الجر (TFM) هي عمليه تقارب القصبات الخلوية باستخدام الحقول الازاحه محرف من علامات ايماني المتولدة من قبل الخلية الملتصقة ومقلص. باستخدام tfm ، وتاثير العظة الميكانيكية في البيئة خارج الخلية علي العمليات الخلوية الهامه مثل الانتشار ، والتمايز ، والهجرة يمكن التحقيق^{1،2،3،4 ،5،6،7،8،9،10،11،12}. لسوء الحظ ، قد يكون من الصعب تنفيذ العديد من النهج الحالية أو تتطلب إلمام بالأداات التحليلية والحسابية عاليه التخصص مما يجعل TFM صعبه للباحثين عديمي الخبرة لاستخدام. ونحن نقدم وصفا لمنهجيه لتوليد منصة TFM التي تزيل بعض الصعوبة في التحليل في حين توفر أيضا الحصول علي البيانات عاليه الانتاجيه.

من النهج الحالية TFM ، والأكثر استخداما لقياس السلالة المادية ينطوي علي ادراج علامات الفلورسنت الصغيرة (عاده نانو أو ميكرومتر الحجم الخرز الفلورسنت) في هيدروجيل تشوه ، مثل بولياكرياميد (PAA) أو بولي (جلايكول الاثيلين) تشكيل (pegda)^13،14،15. وتوفر هذه النهج القائمة علي الخرزات القدرة علي وضع علامات لايماني العنقودية الكثيفة حول خليه ذات اهميه لتعظيم أخذ عينات الازاحه. لسوء الحظ ، لا يمكن السيطرة علي توزيع الخرز في جميع انحاء هيدروجيل مباشره بحيث التنظيم المكاني عشوائي. هذا الوضع العشوائي يؤدي إلى مشاكل مثل الخرز التي هي قريبه جدا من بعضها البعض لحل بدقه ، أو حتى تنتشر ان بقع من الركيزة تسفر عن بيانات ذات جوده منخفضه. كما ان عدم القدرة علي التنبؤ بالمكان الذي تقع فيه علامات الإيماني في غياب الخلايا يخلق قيدا أيضا ، بالنسبة لكل مجموعه تجمع من بيانات جر الخلايا ، يجب أيضا التقاط صوره مرجعيه اضافيه للعلامات الاساسيه في حاله الاسترخاء. الصورة المرجعية مطلوبه بحيث يمكن تقريب الازاحه في الصورة المجهدة كالفرق بين الصور المجهدة وغير المجهدة. ولتحقيق حاله استرخاء ، فان الخلايا التي يجري قياسها اما ان تخفف كيميائيا أو ان تتم ازالتها بالبالكامل. هذه العملية غالبا ما تمنع الحصول علي المزيد من القياسات التجريبية ، ويمنع دراسات الخلايا علي المدى الطويل ، ويحد من الانتاجيه. كما تتطلب الصورة المرجعية تقنيات تسجيل الصور لاستيعاب الانحراف الذي قد يكون حدث اثناء التجريب ، مما يؤدي في كثير من الأحيان إلى المطابقة اليدوية المرهقة لصور حاله الضغط للاشاره إلى الصور.

طرق tfm الأخرى التي تعتبر خاليه من المرجع ، وتنفيذ شكل من اشكال السيطرة علي توزيع علامات الإيماني ، اما عن طريق الطباعة الحجرية عاليه الدقة ، المطبوعة الاتصال المجهري ، أو ميكرومتر^{16،17،18 و19و20}. ويتحقق TFM خاليه من المرجع من خلال افتراض ان حاله استرخاء لكل علامة ايماني يمكن التنبؤ بها استنادا إلى كيفيه وضع علامة وصفت خلال عمليه التصنيع. تسمح هذه الطرق بالتقاط الكامل لحاله التوتر في الخلية داخل التقاط صوره واحده يتم فيها قياس عمليات أزاحه العلامة ايماني بالمقارنة مع مرجع ضمني مما يمكن الاستدلال عليه من هندسه علامة الإيماني. وبينما يتحقق الاتساق في وضع العلامات عاده باستخدام هذه المنصات ، فانها تعاني عموما من أوجه القصور الخاصة بها مقارنه بالنهج القائمة علي الخرزة المستخدمة علي نطاق واسع ، بما في ذلك: 1) انخفاض قرار الجر ؛ 2) انخفاض دقه النزوح خارج الطائرة (في بعض الحالات عدم القدرة الكاملة علي قياس) ؛ و 3) انخفاض تفصيل من ركائز منصة والمواد (علي سبيل المثال ، يجند العرض ، والخواص الميكانيكية).

لمعالجه أوجه القصور هذه ، قمنا بتصميم منصة TFM الجديدة الخالية من الإشارات. تستخدم المنصة الكيمياء المنشطة متعددة الفوتونات للربط بين كميه صغيره من الفلوروفيمور في مواقع محدده ثلاثية الابعاد داخل هيدروجيل التي تعمل كعلامات ايماني لقياس السلالة المادية. وبهذه الطريقة ، قمنا بتصميم منصة تعمل بشكل مماثل للنهج القائمة علي الخرزة ولكن مع الفائدة الكبيرة التي يتم تنظيم علامات ايماني في صفائف الشواية مما يسمح لتتبع سلاله المواد الخالية من المرجع. توفر هذه الخاصية الخالية من الإشارات العديد من المزايا. أولا وقبل كل شيء ، فانه يسمح لرصد غير تدخليه من الدول الجر الخلوية (اي ، التفاف علي الحاجة إلى الاسترخاء أو أزاله الخلايا للحصول علي المواقع المرجعية من علامات ايماني النازحين). وكان هذا هو هدفنا الأساسي في تصميم هذا النظام ، ونحن عازمون علي دمج الأساليب التحليلية الأخرى المصب جنبا إلى جنب مع TFM ، والتي يمكن ان تكون صعبه مع النهج المدمرة TFM نقطه النهاية. ثانيا ، استخدام مرجع ضمني يستند إلى صفائف موزع جيس يسمح لاتمته شبه كامله من تحليل الازاحه. ويؤدي انتظام المصفوفات إلى إنشاء سير عمل يمكن التنبؤ به حيث يمكن الحفاظ علي الحد الأدنى من حالات الحالات الاستثنائية (اي ، نموذج بيانات الخلية التي تحتوي علي تحف غير متوقعه مثل تباعد العلامات دون الأمثل أو تفاوتات التسجيل). ثالثا ، التخلي عن الحاجة إلى الحصول علي صوره مرجعيه يوفر الحرية لرصد العديد من الخلايا علي عينه واحده علي مدي فترات طويلة من الزمن. وهذا يتناقض مع النهج التقليدية القائمة علي حبه ، حيث ، اعتمادا علي الإخلاص من الحركات المرحلة الألى المجهر ، يمكن ان تتراكم الأخطاء في تحديد المواقع وزيادة صعوبة تسجيل الصور المرجعية بشكل صحيح إلى توتر الخلية الصور. وعموما ، تسهل هذه المنصة إنتاجيه اعلي في جمع بيانات التوتر الخلوي.

مع هذا البروتوكول ، ونحن نامل في تعريف القراء مع اثنين من الفوتون ، ليزر المسح الحجري تقنيه الطباعة التي قمنا بتنفيذها لتوليد هذا منصة TFM خاليه من الإشارات لقياس مكونات الجر في الطائرة وخارج الطائرة التي تولدها الخلايا المصنفة علي السطح. غير مشمولة في هذا البروتوكول هو توليف بعض المكونات مونوميريك. وبصفه عامه ، تتضمن ردود الفعل هذه ما يكاد يكون مطابقا لمخططات التفاعل التوليفي “الواحد” الموصوفة سابقا بأنها²¹، ويمكن أيضا شراء بدائل لهذه المنتجات. ونحن نهدف أيضا إلى تعريف القراء بالأداات المستندة إلى البرامج التي قمنا بإنشاءها لتعزيز استخدام مجاهر المسح بالليزر المتاحة تجاريا كاداات طباعه ثلاثية الابعاد ولتسهيل تحليل عمليات أزاحه علامات الإيماني.

Protocol

1. فوتوبوليميرينج قاعده الهيدروجيل جمع الكواشف جمع الليثيوم فينيل-2 ، 4 ، 6-تريميثيلالبنبيزيلفوسفونات (اللفة) ، 3.4 كدي بولي (الاثيلين) غليكول التشكيل (PEGDA) ، ن-الفينيل بيروليتم (NVP) ، اليكسافلور 488 المسمي PEGDA (PEG-488) ، اليكسافلور 633 المسمي PEGDA (PEG-633) ، و PEGylated RGDS الببتيد ( PEG-RGDS) من ا…

Representative Results

وفي جميع مراحل البروتوكول ، هناك عدد من نقاط التفتيش التي توفر التغذية المرتدة لتقييم نوعيه الاجراء الزخرفة. ولتقديم بعض الأفكار بشان كيفيه تقييم التقدم المحرز في كل نقطه من نقاط التفتيش هذه ، نقدم نتائج تمثيليه للتجربة الفعلية. وتسلط النتائج الضوء علي تطبيق هذا البروتوكول الذي اجري علي ?…

Discussion

الهدف من هذا البروتوكول هو توفير سير عمل يخفف كثيرا من الصعوبة المرتبطة بتوليد وتحليل بيانات TFM. وبمجرد الاعداد ، فان الفوتوباتيرنيد المائية سهله الاستخدام ، مما يتطلب معرفه الممارسات الثقافية القياسية للانسجه والمجهر الفلوري. ويتيح الجانب الخالي من الإشارات التنقل الحر علي الهلام الما?…

Materials

Acrodisc Syringe Filter, 0.2 μm Supor Membrane, Low Protein Binding	Pall	PN 4602	Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.
Acrylate-Silane Functionalized #1.5 Coverslips	in-house	in-house	Acrylates allow binding of base hydrogel to the glass surface to immobilize the hydrogels. See reference: 21-24
Axio-Observer Z1 w/Apotome	Zeiss		Widefield microscope with structured illumination module used to capture images for TFM.
Chameleon Vision ii	Coherent Inc.		Equipped on laser-scanning microscope used for multiphoton Lithography.
Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil	3M		Binds acrylate-silane functionalized coverslips to Petri dishes.
Flexmark90 PFW Liner	FLEXcon	FLX000620	Allows lining of double coated tape enabling feeding of tape into plotter.
LSM-880	Zeiss		Laser-Scanning microscope used for Multiphoton Lithography.
MATLAB	Mathworks	R2018a	Runs custom scripts to generate lithography instructions for microscope and for analysis of TFM data.
Model SC Plotter	USCutter	SC631E	Cuts double coated tape into rings to bind coverslips to petri dishes.
Objective C-Apochromat 40x/1.20 W Corr M27	Zeiss		Equipped on both widefield microscope and laser-scanning microscope to be used for both lithography and TFM.
PEG-AF633	in-house	in-house	Fluorophore-labeled acrylate PEG variant for creating fiducial markers. See reference: 21
PEG-DA	in-house	in-house	Base material for hydrogels. See reference: 21
PEG-RGDS	in-house	in-house	RGDS peptide-labeled mono-acrylate PEG variant for promoting cell-adhesion. See reference: 21
Petri Dishes	CELLTREAT	229638	8mm holes are cut into the center of each dish using a coring bit to fit base hydrogels.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	3097358-1004	For creating spacers to control base hydrogel thickness (aka PDMS).
Syringe, Leur-Lok, 1 mL	BD	309628	Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.
UV Lamp	UVP	Blak-Ray® B-100AP	Polymerizes base hydrogel.
1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP)	Sigma-Aldrich	V3409-5G	Radical accelerant and co-monomer. Improves pegylated fluorophore incorporation during lithography.