레퍼런스 프리 견인력 현미경 플랫폼 제작 및 구현
Summary
이 프로토콜은 참조가 없는 견인력 현미경으로 사용하기 위해 폴리(에틸렌 글리콜) 기반 하이드로겔에 내장된 형광 선한 마커의 3차원 배열을 제작하기 위해 다광자 리소그래피를 구현하기 위한 지침을 제공합니다. 플랫폼. 이 지침을 사용하여 3D 재료 변형률 측정 및 셀룰러 견인 계산이 단순화되어 고처리량 견인력 측정을 촉진합니다.
Abstract
세포 유도 물질 변형을 정량화하면 세포가 미세 환경의 물리적 특성을 감지하고 반응하는 방법에 관한 유용한 정보를 제공합니다. 세포 유도 물질 변형을 측정하기 위한 많은 접근법이 존재하지만, 여기서는 참조가 없는 방식으로 서브 미론 분해능으로 균주를 모니터링하는 방법을 제공합니다. 2 광자 활성화 포토리소그래피 패터닝 공정을 사용하여 형광 피공 마커의 내장 된 배열을 포함하는 기계적 및 생체 능동 적으로 조정 가능한 합성 기판을 생성하여 3 차원을 쉽게 측정하는 방법을 보여줍니다. 3D) 표면 견인에 대한 응답으로 재료 변형 프로파일. 이러한 기판을 사용하여, 세포 장력 프로파일은 관심 셀의 단일 3D 이미지 스택을 사용하여 매핑될 수 있다. 이 방법론을 가진 우리의 목표는 견인력 현미경 검사법을 세포 mechanotransduction 프로세스를 공부하는 연구원을 위한 공구를, 특히 필드에 이민자를 위한 공구를 실행하기 위하여 더 접근하고 쉽게 만드는 것입니다.
Introduction
견인력 현미경 검사법(TFM)은 부착 및 수축 세포에 의해 생성된 신탁 마커의 보간된 변위 필드를 사용하여 셀룰러 견인을 근사화하는 과정입니다. TFM을 사용하여 증식, 분화 및 이동과 같은 중요한 세포 과정에 대한 세포 외 환경에서의 기계적 단서의 영향을1,2,3,4로 조사할 수 있습니다. 5,6,7,8,9,10,11,12. 안타깝게도 많은 기존 접근 방식은 고도로 전문화된 분석 및 계산 도구에 익숙해지기 어렵거나 경험이 없는 연구자가 TFM을 사용하기 어렵게 만들 수 있습니다. TFM 플랫폼을 생성하는 방법론을 설명하며, 이는 분석의 어려움을 제거하는 동시에 높은 처리량의 데이터 수집을 제공합니다.
기존의 TFM 접근법 중, 재료 변형을 정량화하는 데 가장 일반적으로 사용되는 것은 폴리아크릴아미드 (PAA) 또는 폴리와 같은 변형 가능한 하이드로겔에 작은 형광 마커 (일반적으로 나노 또는 마이크로 미터 크기의 형광 비드)를 통합하는 것을 포함합니다. (에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트 (PEGDA)13,14,15. 이러한 비드 기반 접근법은 관심 셀 주위의 fiducial 마커를 조밀하게 클러스터화하여 변위 샘플링을 최대화하는 기능을 제공합니다. 불행히도, 하이드로겔 전체에 걸쳐 비드의 분포는 공간 조직이 무작위이도록 직접 제어될 수 없다. 이러한 무작위 배치는 비드가 서로 너무 가까워서 정확하게 해결하거나, 기판의 패치가 낮은 품질의 데이터를 생성하도록 확산되는 등의 문제를 초래합니다. 셀이 없는 상태에서 fiducial 마커가 있는 위치를 예측할 수 없는 것은 또한 수집된 모든 셀 견인 데이터 집합에 대해 완화된 상태의 기본 마커의 추가 참조 이미지도 캡처해야 하는 제약 조건을 만듭니다. 응력 이미지의 변위가 응력 이미지와 응력 없는 이미지의 차이로 근사화될 수 있도록 참조 이미지가 필요합니다. 완화 된 상태를 달성 하기 위해, 측정 되 고 세포는 화학적으로 이완 또는 완전히 제거. 이 프로세스는 종종 추가 실험 측정의 수집을 방지, 장기 세포 연구를 억제, 및 처리량을 제한. 또한 참조 이미지에는 실험 중에 발생할 수 있는 드리프트를 수용하기 위한 이미지 등록 기술이 필요하며, 종종 스트레스 상태 이미지를 참조하기 위해 번거로운 수동 일치를 초래합니다.
참조가 없는 것으로 간주되는 다른 TFM 방법, 고해상도 리소그래피, 마이크로 접촉 인쇄 또는 마이크로 몰딩16,17,18에 의해 fiducial 마커의 분포에 대한 제어의 일부 형태를 구현 ,19,20. 참조없는 TFM은 제조 과정에서 마커 위치가 어떻게 처방되었는지에 따라 각 신탁 마커에 대한 완화 된 상태를 예측 할 수 있다는 가정을 통해 달성됩니다. 이러한 방법을 사용하면 fiducial 마커 기하학에서 유추할 수 있는 것보다 암시적 참조와 비교하여 fiducial 마커 변위를 측정하는 단일 이미지 캡처 내에서 셀의 장력 상태를 완벽하게 캡처할 수 있습니다. 마커 배치의 일관성은 일반적으로 이러한 플랫폼을 사용하여 달성되지만, 일반적으로 다음과 같은 널리 사용되는 비드 기반 접근 방식에 비해 자신의 단점으로 고통: 1) 감소 견인 해상도; 2) 평면 외 변위의 정확도 감소(경우에 따라 측정할 수 없는 경우); 및 3) 플랫폼 기판 및 재료 (예 : 리간드 프리젠 테이션, 기계적 특성)의 사용자 정의성을 감소시다.
이러한 단점을 해결하기 위해 새로운 참조 없는 TFM 플랫폼을 설계했습니다. 이 플랫폼은 다광자 활성화 화학을 활용하여 소량의 플루오로포를 하이드로겔 내의 특정 3D 위치로 상호 연결하여 재료 변형을 측정하는 신탁 마커 역할을 합니다. 이러한 방식으로 당사는 비드 기반 접근법과 유사하게 작동하는 플랫폼을 설계했지만, 신탁 마커가 참조가 없는 재료 변형 추적을 허용하는 격자 형 배열로 구성되는 상당한 이점을 가지고 있습니다. 이 참조가없는 속성은 많은 장점을 제공합니다. 무엇보다도, 그것은 세포 견인 상태의 비 관입 모니터링을 허용합니다 (즉, 변위 된 신탁 마커의 참조 위치를 획득하기 위해 세포를 이완하거나 제거 할 필요성을 우회합니다). 이것은 파괴적인 엔드 포인트 TFM 접근 방식으로 어려울 수 있는 TFM과 함께 다른 다운스트림 분석 방법을 통합하기 위해 이 시스템을 설계하는 데 있어 우리의 주요 목표였습니다. 둘째, 격자 형 배열을 기반으로 암시적 참조를 사용하면 변위 분석을 거의 완벽하게 자동화 할 수 있습니다. 배열의 규칙성은 예외적인 경우(예기치 않은 마커 간격 또는 등록 불일치와 같은 예기치 않은 아티팩트를 포함하는 샘플 셀 데이터)의 발생을 최소한으로 유지할 수 있는 예측 가능한 워크플로우를 만듭니다. 셋째, 참조 이미지를 획득할 필요성을 간지러이한 것은 오랜 시간 동안 단일 샘플에서 많은 세포를 모니터링할 수 있는 자유를 제공한다. 이는 현미경의 자동 단계 움직임의 충실도에 따라 위치 설정의 오류가 누적되어 세포 장력에 참조 이미지를 적절하게 등록하는 어려움을 증가시킬 수 있는 기존의 비드 기반 접근법과 대조됩니다. 이미지. 전반적으로 이 플랫폼은 셀룰러 장력 데이터 수집시 더 높은 처리량을 용이하게 합니다.
이 프로토콜을 통해 우리는 이 참조가 없는 TFM 플랫폼을 생성하기 위해 구현한 2광자, 레이저 스캐닝 리소그래피 기술로 독자에게 익숙해지도록 하여 시드된 세포에 의해 생성된 평면 및 평면 외 견인 구성 요소를 측정할 수 있기를 바랍니다. 표면에. 이 프로토콜에서는 다루지 않는 일부 단일 성분의 합성입니다. 일반적으로, 이들 반응은 앞서21에설명된 거의 동일한 “원팟” 합성 반응 방식을 포함하며, 이들 제품에 대한 대안도 구매할 수 있다. 또한 시판되는 레이저 스캐닝 현미경을 3D 프린팅 도구로 사용하고 피신 마커 변위 분석을 용이하게 하기 위해 생성된 소프트웨어 기반 도구를 독자에게 숙지하는 것을 목표로 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜의 목표는 TFM 데이터의 생성 및 분석과 관련된 많은 어려움을 완화하는 워크플로우를 제공하는 것입니다. 일단 준비되면, photopatterned 하이드로겔은 표준 조직 배양 사례 및 형광 현미경 검사법의 지식만 요구하는 사용이 간단합니다. 참조가 없는 측면은 셀 라덴 하이드로겔에서 평온한 탐색을 가능하게 하며 참조 및 변형된 이미지 간의 이미지 등록과 같은 번거로운 이미지 처리 단계?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O. A. 반다 NSF IGERT SBE2 펠로우십 (1144726), 델라웨어 대학에서 제공하는 스타트업 기금, 국립 보건 원 /국립 암 연구소 IMAT 프로그램 (R21CA214299)의 자금 지원으로 지원되었습니다. JHS는 국립 보건원/국립 암 연구소 IMAT 프로그램(R21CA214299)과 국립 과학 재단 경력 상 프로그램(1751797)의 자금 지원을 받고 있습니다. 현미경 접근은 NIH-NIGMS (P20 GM103446), NSF (IIA-1301765) 및 델라웨어 주에서 보조금에 의해 지원되었습니다. 구조화 된 조명 현미경은 델라웨어 주 연방 연구 개발 보조금 프로그램 (16A00471)의 자금으로 인수되었습니다. 2광자 레이저 스캐닝 리소그래피에 사용되는 LSM880 공초점 현미경은 공유 계측 보조금(S10 OD016361)으로 획득하였다.
Materials
| Acrodisc Syringe Filter, 0.2 μm Supor Membrane, Low Protein Binding | Pall | PN 4602 | Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps. |
| Acrylate-Silane Functionalized #1.5 Coverslips | in-house | in-house | Acrylates allow binding of base hydrogel to the glass surface to immobilize the hydrogels. See reference: 21-24 |
| Axio-Observer Z1 w/Apotome | Zeiss | Widefield microscope with structured illumination module used to capture images for TFM. | |
| Chameleon Vision ii | Coherent Inc. | Equipped on laser-scanning microscope used for multiphoton Lithography. | |
| Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil | 3M | Binds acrylate-silane functionalized coverslips to Petri dishes. | |
| Flexmark90 PFW Liner | FLEXcon | FLX000620 | Allows lining of double coated tape enabling feeding of tape into plotter. |
| LSM-880 | Zeiss | Laser-Scanning microscope used for Multiphoton Lithography. | |
| MATLAB | Mathworks | R2018a | Runs custom scripts to generate lithography instructions for microscope and for analysis of TFM data. |
| Model SC Plotter | USCutter | SC631E | Cuts double coated tape into rings to bind coverslips to petri dishes. |
| Objective C-Apochromat 40x/1.20 W Corr M27 | Zeiss | Equipped on both widefield microscope and laser-scanning microscope to be used for both lithography and TFM. | |
| PEG-AF633 | in-house | in-house | Fluorophore-labeled acrylate PEG variant for creating fiducial markers. See reference: 21 |
| PEG-DA | in-house | in-house | Base material for hydrogels. See reference: 21 |
| PEG-RGDS | in-house | in-house | RGDS peptide-labeled mono-acrylate PEG variant for promoting cell-adhesion. See reference: 21 |
| Petri Dishes | CELLTREAT | 229638 | 8mm holes are cut into the center of each dish using a coring bit to fit base hydrogels. |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 3097358-1004 | For creating spacers to control base hydrogel thickness (aka PDMS). |
| Syringe, Leur-Lok, 1 mL | BD | 309628 | Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps. |
| UV Lamp | UVP | Blak-Ray® B-100AP | Polymerizes base hydrogel. |
| 1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409-5G | Radical accelerant and co-monomer. Improves pegylated fluorophore incorporation during lithography. |
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