Herstellung und Implementierung einer referenzfreien Traktionskraftmikroskopie-Plattform

Summary

Dieses Protokoll enthält Anweisungen für die Implementierung der Multiphotonenlithographie zur Herstellung dreidimensionaler Arrays von fluoreszierenden Fiduzialen, die in poly(ethylengglykol)-basierte Hydrogele eingebettet sind und als referenzfreie Traktionskraftmikroskopie verwendet werden können. Plattformen. Anhand dieser Anleitungen wird die Messung der 3D-Materialdehnung und die Berechnung der zellulären Traktionen vereinfacht, um Messungen der Traktionskraft mit hohem Durchsatz zu fördern.

Abstract

Die Quantifizierung der zellinduzierten Materialverformung liefert nützliche Informationen darüber, wie Zellen die physikalischen Eigenschaften ihrer Mikroumgebung erkennen und darauf reagieren. Während es viele Ansätze zur Messung zellinduzierter Materialstämme gibt, bieten wir hier eine Methodik zur referenzfreien Dehnungsüberwachung mit Submikronen-Auflösung an. Mit einem zweiphotonenaktivierten photolithographischen Musterverfahren zeigen wir, wie mechanisch und bioaktiv abstimmbare synthetische Substrate mit eingebetteten Arrays von fluoreszierenden Fiduzialenmarkern erzeugt werden, um dreidimensionale ( 3D) Materialverformungsprofile als Reaktion auf Oberflächentraktionen. Mit diesen Substraten können Zellspannungsprofile mit einem einzelnen 3D-Bildstapel einer von Interesse stehenden Zelle abgebildet werden. Unser Ziel mit dieser Methode ist es, die Traktionskraftmikroskopie zu einem zugänglicheren und einfacher zu implementierenden Werkzeug für Forscher zu machen, die zelluläre Mechanotransduktionsprozesse untersuchen, insbesondere Neulinge auf dem Gebiet.

Introduction

Die Traktionskraftmikroskopie (TFM) ist der Prozess der Annäherung zellulärer Traktionen unter Verwendung interpolierter Verschiebungsfelder von Treuhandmarkern, die von einer anhängerhaften und kontraktilen Zelle erzeugt werden. Mit TFM kann der Einfluss mechanischer Hinweise in der extrazellulären Umgebung auf wichtige zelluläre Prozesse wie Proliferation, Differenzierung und Migration untersucht werden^{1,2,3,4 ,5,6,7,8,9,10,11,12}. Leider können viele vorhandene Ansätze schwierig zu implementieren sein oder erfordern vertraut mit hochspezialisierten Analyse- und Rechenwerkzeugen, was die Verwendung von TFM für unerfahrene Forscher erschwert. Wir beschreiben eine Methode zur Generierung einer TFM-Plattform, die einige der Schwierigkeiten bei der Analyse eliminiert und gleichzeitig eine Datenerfassung mit hohem Durchsatz bietet.

Von den bestehenden TFM-Ansätzen umfasst die am häufigsten zur Quantifizierung der Materialdehnung verwendete Die Einbeziehung kleiner fluoreszierender Marker (typischerweise nano- oder mikrometergroße Fluoreszenzperlen) in ein verformbares Hydrogel, wie Polyacrylamid (PAA) oder Polypoly (Ethylenglykol) Diakrylat (PEGDA)^13,14,15. Diese auf Perlen basierenden Ansätze bieten die Möglichkeit, fiduziale Marker dicht um eine Zelle von Interesse zu gruppieren, um die Verschiebungsprobezuszeit zu maximieren. Leider kann die Verteilung der Perlen im hydrogel nicht direkt gesteuert werden, so dass die räumliche Organisation zufällig ist. Diese zufällige Platzierung führt zu Problemen wie Perlen, die zu nah beieinander sind, um sie genau zu lösen, oder so verbreiten, dass Flecken des Substrats Daten niedriger Qualität liefern. Die Unfähigkeit vorherzusagen, wo fiducial Marker in Abwesenheit von Zellen liegen, schafft auch eine Einschränkung, dass für jeden gesammelten Satz von Zelltraktionsdaten auch ein zusätzliches Referenzbild der zugrunde liegenden Marker in einem entspannten Zustand erfasst werden muss. Das Referenzbild ist erforderlich, damit die Verschiebung im beanspruchten Bild als Differenz zwischen den gestressten und unbetonten Bildern angenähert werden kann. Um einen entspannten Zustand zu erreichen, werden die zu messenden Zellen entweder chemisch entspannt oder vollständig entfernt. Dieser Prozess verhindert oft die Erfassung weiterer experimenteller Messungen, hemmt Langzeitzellstudien und begrenzt den Durchsatz. Ein Referenzbild erfordert auch Bildregistrierungstechniken, um Driften zu ermöglichen, die während des Experimentierens aufgetreten sein können, was oft zu einer umständlichen manuellen Abgleich von Spannungszustandsbildern zu Referenzbildern führt.

Andere TFM-Methoden, die als referenzfrei gelten, implementieren irgendeine Form der Kontrolle über die Verteilung von Treuhandmarkern, entweder durch hochauflösende Lithographie, Mikrokontaktdruck oder Mikrospritzen^{16,17,18 ,19,20}. Referenzfreies TFM wird durch die Annahme erreicht, dass der entspannte Zustand für jeden Treuhandmarker basierend darauf vorhergesagt werden kann, wie Markerpositionen während des Herstellungsprozesses vorgeschrieben wurden. Diese Methoden ermöglichen eine vollständige Erfassung des Spannungszustands einer Zelle innerhalb einer einzelnen Bildaufnahme, bei der die räumlichen Markerverschiebungen im Vergleich zu einer impliziten Referenz gemessen werden, als aus der fiducialmarker-Geometrie abgeleitet werden kann. Während die Konsistenz bei der Markerplatzierung in der Regel mit diesen Plattformen erreicht wird, leiden sie im Allgemeinen unter ihren eigenen Mängeln im Vergleich zu den weit verbreiteten, auf Perlen basierenden Ansätzen, einschließlich: 1) verringerter Traktionsauflösung; 2) verringerte Genauigkeit von Verschiebungen a-ebenen (in einigen Fällen eine vollständige Unfähigkeit zu messen); und 3) verminderte Anpassbarkeit von Plattformsubstraten und Materialien (z. B. Ligandendarstellung, mechanische Eigenschaften).

Um diese Mängel zu beheben, haben wir eine neue referenzfreie TFM-Plattform entwickelt. Die Plattform nutzt multiphotonaktivierte Chemie, um ein kleines Volumen eines Fluorophors mit bestimmten 3D-Positionen innerhalb des Hydrogels zu vernetzen, die als Treuhandmarker zur Messung der Materialbelastung dienen. Auf diese Weise haben wir eine Plattform entwickelt, die ähnlich wie perlenbasierte Ansätze funktioniert, aber mit dem erheblichen Vorteil, dass treue Marker in gerasterte Arrays organisiert sind, die eine referenzfreie Materialdehnungsverfolgung ermöglichen. Diese referenzfreie Immobilie bietet viele Vorteile. In erster Linie ermöglicht es eine nicht-intrusive Überwachung von zellulären Traktionszuständen (d. h. umgeht die Notwendigkeit, Zellen zu entspannen oder zu entfernen, um Referenzpositionen von verdrängten Treuhandmarkern zu erhalten). Dies war unser primäres Ziel bei der Entwicklung dieses Systems, da wir beabsichtigten, andere nachgelagerte Analysemethoden in Verbindung mit TFM zu integrieren, was mit zerstörerischen Endpunkt-TFM-Ansätzen schwierig sein kann. Zweitens ermöglicht die Verwendung einer impliziten Referenz basierend auf gerasterten Arrays eine nahezu vollständige Automatisierung der Verschiebungsanalyse. Die Regelmäßigkeit der Arrays erzeugt einen vorhersagbaren Workflow, bei dem das Auftreten von Ausnahmefällen (d. h. Beispielzellendaten, die unerwartete Artefakte wie suboptimale Markerabstände oder Registrierungsübereinstimmungen enthalten) auf einem Minimum beibehalten werden kann. Drittens bietet der Weg fallder ein Referenzbild die Freiheit, viele Zellen in einer einzigen Probe über einen längeren Zeitraum zu überwachen. Dies steht im Gegensatz zu herkömmlichen Perlen-basierten Ansätzen, bei denen sich je nach Genauigkeit der automatisierten Bühnenbewegungen des Mikroskops Fehler bei der Positionierung ansammeln und die Schwierigkeit erhöhen können, Referenzbilder auf Zellspannung richtig zu registrieren. Bilder. Insgesamt ermöglicht diese Plattform einen höheren Durchsatz beim Sammeln zellulärer Spannungsdaten.

Mit diesem Protokoll hoffen wir, die Leser mit der zwei-Photonen- laserscannenden Lithographie-Technik vertraut zu machen, die wir implementiert haben, um diese referenzfreie TFM-Plattform zu generieren, um in-plane und a-plane Traktionskomponenten zu messen, die von Zellen erzeugt werden, die ausgesät werden. auf der Oberfläche. Nicht in diesem Protokoll enthalten ist die Synthese einiger monomerer Komponenten. Im Allgemeinen umfassen diese Reaktionen fast identische “Ein-Topf”-Synthese-Reaktionsschemata, die zuvor²¹beschrieben wurden, und Alternativen zu diesen Produkten können ebenfalls gekauft werden. Unser Ziel ist es auch, die Leser mit den softwarebasierten Tools vertraut zu machen, die wir erstellt haben, um den Einsatz von handelsüblichen Laser-Scanning-Mikroskopen als 3D-Druckwerkzeuge zu fördern und die Analyse von fiduzialen Markerverschiebungen zu erleichtern.

Protocol

1. Photopolymerisierung eines PEGDA-Basishydrogels Sammeln von Reagenzien Sammeln Sie Lithiumphenyl-2,4,6-Trimethylbenzoylphosphinat (LAP), 3,4 kDa-Poly(Ethylen)-Glykoldiakrylat (PEGDA), n-Vinylpyrrolidon (NVP), AlexaFluor 488 mit PEGDA (PEG-488), AlexaFluor 633 mit PEGDA (PEG-633) und PEGylatiertem RGDS-Peptid ( PEG-RGDS) aus den jeweiligen Gefriertruhen und bringen sie jeweils auf Raumtemperatur. In separaten Bernstein-Mikrozentrifugenröhrchen 3 mg LAP, 10 mg PEGDA, 5 m…

Representative Results

Im gesamten Protokoll gibt es eine Reihe von Prüfpunkten, die Feedback geben, um die Qualität des Mustervorgangs zu bewerten. Um einen Einblick in die Bewertung der Fortschritte an jedem dieser Kontrollpunkte zu geben, liefern wir repräsentative Ergebnisse eines tatsächlichen Experiments. Die Ergebnisse unterstreichen die Anwendung dieses Protokolls auf einem photomusterten Hydrogel, das für die TFM-Analyse menschlicher Nabelvenenen-Endothelzellen (HUVECs) vorbereitet wurde. Die Ergebnisse umfassen Rohbilddaten sowi…

Discussion

Das Ziel dieses Protokolls ist es, einen Workflow bereitzustellen, der einen Großteil der Schwierigkeiten im Zusammenhang mit der Generierung und Analyse von TFM-Daten lindert. Einmal zubereitet, sind die photomusterten Hydrogele einfach zu bedienen und erfordern nur Kenntnisse der Standard-Gewebekulturpraktiken und der Fluoreszenzmikroskopie. Der referenzfreie Aspekt ermöglicht eine sorglose Navigation auf zellbeladenen Hydrogelen und eliminiert umständliche Bildverarbeitungsschritte wie die Bildregistrierung zwische…

Materials

Acrodisc Syringe Filter, 0.2 μm Supor Membrane, Low Protein Binding	Pall	PN 4602	Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.
Acrylate-Silane Functionalized #1.5 Coverslips	in-house	in-house	Acrylates allow binding of base hydrogel to the glass surface to immobilize the hydrogels. See reference: 21-24
Axio-Observer Z1 w/Apotome	Zeiss		Widefield microscope with structured illumination module used to capture images for TFM.
Chameleon Vision ii	Coherent Inc.		Equipped on laser-scanning microscope used for multiphoton Lithography.
Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil	3M		Binds acrylate-silane functionalized coverslips to Petri dishes.
Flexmark90 PFW Liner	FLEXcon	FLX000620	Allows lining of double coated tape enabling feeding of tape into plotter.
LSM-880	Zeiss		Laser-Scanning microscope used for Multiphoton Lithography.
MATLAB	Mathworks	R2018a	Runs custom scripts to generate lithography instructions for microscope and for analysis of TFM data.
Model SC Plotter	USCutter	SC631E	Cuts double coated tape into rings to bind coverslips to petri dishes.
Objective C-Apochromat 40x/1.20 W Corr M27	Zeiss		Equipped on both widefield microscope and laser-scanning microscope to be used for both lithography and TFM.
PEG-AF633	in-house	in-house	Fluorophore-labeled acrylate PEG variant for creating fiducial markers. See reference: 21
PEG-DA	in-house	in-house	Base material for hydrogels. See reference: 21
PEG-RGDS	in-house	in-house	RGDS peptide-labeled mono-acrylate PEG variant for promoting cell-adhesion. See reference: 21
Petri Dishes	CELLTREAT	229638	8mm holes are cut into the center of each dish using a coring bit to fit base hydrogels.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	3097358-1004	For creating spacers to control base hydrogel thickness (aka PDMS).
Syringe, Leur-Lok, 1 mL	BD	309628	Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.
UV Lamp	UVP	Blak-Ray® B-100AP	Polymerizes base hydrogel.
1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP)	Sigma-Aldrich	V3409-5G	Radical accelerant and co-monomer. Improves pegylated fluorophore incorporation during lithography.