Fabbricazione e implementazione di una piattaforma di microscopia della forza di trazione senza riferimenti

Summary

Questo protocollo fornisce istruzioni per l’implementazione della litografia multifotone per fabbricare array tridimensionali di marcatori fiduciari fluorescenti incorporati in idrogel a base di poli(etilene glicole) per l’uso come microscopia a forza di trazione senza riferimenti Piattaforme. Utilizzando queste istruzioni, la misurazione della deformazione del materiale 3D e il calcolo delle trazioni cellulari è semplificata per promuovere misurazioni della forza di trazione ad alta produttività.

Abstract

La quantificazione della deformazione del materiale indotta dalle cellule fornisce informazioni utili sul modo in cui le cellule rilevano e rispondono alle proprietà fisiche del loro microambiente. Sebbene esistano molti approcci per misurare la deformazione dei materiali indotta dalle cellule, qui forniamo una metodologia per monitorare la deformazione con risoluzione sub-micron in modo privo di riferimenti. Utilizzando un processo di modellazione fotolitografica attivata a due fotoni, dimostriamo come generare substrati sintetici meccanicamente e bio-attivamente regolabili contenenti array incorporati di marcatori fiduciali fluorescenti per misurare facilmente tridimensionali ( 3D) profili di deformazione del materiale in risposta alle trazioni superficiali. Utilizzando questi substrati, i profili di tensione delle cellule possono essere mappati utilizzando una singola pila di immagini 3D di una cella di interesse. Il nostro obiettivo con questa metodologia è quello di rendere la microscopia a trazione uno strumento più accessibile e più facile da implementare per i ricercatori che studiano i processi di meccanotrazione cellulare, in particolare i nuovi arrivati sul campo.

Introduction

La microscopia a forza di trazione (TFM) è il processo di approssimazione delle trazioni cellulari utilizzando campi di spostamento interpolati di marcatori fiduciari generati da una cellula aderente e contrattile. Utilizzando TFM, l’influenza dei segnali meccanici nell’ambiente extracellulare su importanti processi cellulari come la proliferazione, la differenziazione e la migrazione può essere studiata^{1,2,3,4 ,5,6,7,8,9,10,11,12}. Sfortunatamente, molti approcci esistenti possono essere difficili da implementare o richiedono familiarità con strumenti analitici e computazionali altamente specializzati che rendono la TFM difficile da usare per i ricercatori inesperti. Descriviamo una metodologia per generare una piattaforma TFM che elimina alcune delle difficoltà nell’analisi, fornendo allo stesso tempo l’acquisizione di dati ad alto eveloce.

Tra gli attuali approcci TFM, i più comunemente utilizzati per quantificare la deformazione del ceppo materiale comporta l’incorporazione di piccoli marcatori fluorescenti (tipicamente perline fluorescenti di dimensioni nanometriche o micrometriche) in un idrogel deformabile, come la poliacrilammide (PAA) o il polimetro (etilene glicole) diacrilato (PEGDA)^13,14,15. Questi approcci basati sul tallone forniscono la capacità di ammassare densamente marcatori fiduciari intorno a una cella di interesse per massimizzare il campionamento di spostamento. Sfortunatamente, la distribuzione delle perline in tutto l’idrogel non può essere controllata direttamente, quindi l’organizzazione spaziale è casuale. Questo posizionamento casuale porta a problemi come perline che sono troppo vicine l’una all’altra per risolvere con precisione, o così diffuse che le patch del substrato producono dati di bassa qualità. L’incapacità di prevedere dove si trovano i marcatori fiduciari in assenza di cellule crea anche un vincolo che, per ogni insieme raccolto di dati di trazione cellulare, deve essere acquisita anche un’immagine di riferimento aggiuntiva dei marcatori sottostanti in uno stato rilassato. L’immagine di riferimento è necessaria in modo che lo spostamento nell’immagine sollecitata possa essere approssimato come differenza tra le immagini sollecitate e non sollecitate. Per ottenere uno stato rilassato, le cellule misurate sono chimicamente rilassate o completamente rimosse. Questo processo spesso impedisce l’acquisizione di ulteriori misurazioni sperimentali, inibisce gli studi sulle cellule a lungo termine e limita la produttività. Un’immagine di riferimento richiede anche tecniche di registrazione delle immagini per accogliere la deriva che potrebbe essersi verificata durante la sperimentazione, spesso portando a un ingombrante abbinamento manuale delle immagini dello stato di sollecitazione alle immagini di riferimento.

Altri metodi TFM considerati privi di riferimento, implementano una qualche forma di controllo sulla distribuzione dei marcatori fiduciari, sia mediante litografia ad alta risoluzione, stampa di microcontatto o micromolding^{16,17,18 ,19,20}. La TFM senza riferimenti si ottiene presupponendo che lo stato rilassato per ogni marcatore fiduciario possa essere previsto in base al modo in cui le posizioni dei marcatori sono state prescritte durante il processo di fabbricazione. Questi metodi consentono di acquisire completamente lo stato di tensione di una cella all’interno di una singola acquisizione di immagine in cui gli spostamenti dei marcatori fiduciari vengono misurati rispetto a un riferimento implicito di quanto possa essere dedotto dalla geometria del marcatore fiduciario. Mentre la coerenza nel posizionamento dei marcatori è in genere raggiunta utilizzando queste piattaforme, in genere soffrono di carenze proprie rispetto agli approcci basati sul tallone ampiamente utilizzati, tra cui: 1) diminuzione della risoluzione di trazione; 2) diminuzione della precisione degli spostamenti fuori piano (in alcuni casi una completa incapacità di misurare); e 3) diminuzione della personalizzazione dei substrati e dei materiali della piattaforma (ad esempio, presentazione del ligando, proprietà meccaniche).

Per far fronte a queste carenze, abbiamo progettato una nuova piattaforma TFM senza riferimenti. La piattaforma utilizza la chimica attivata multifotone per incrociare un piccolo volume di un fluoroforo in specifiche posizioni 3D all’interno dell’idrogel che fungono da marcatori fiduciali per misurare la varietà del materiale. In questo modo, abbiamo progettato una piattaforma che opera in modo simile ad approcci basati su perline, ma con il vantaggio significativo che i marcatori fiduciali sono organizzati in array grigliati che consentono il tracciamento della deformazione dei materiali senza riferimenti. Questa proprietà senza riferimenti offre molti vantaggi. In primo luogo, permette un monitoraggio non intrusivo degli stati di trazione cellulare (cioè, elude la necessità di rilassare o rimuovere le cellule per acquisire posizioni di riferimento di marcatori fiduciari spostati). Questo era il nostro obiettivo primario nella progettazione di questo sistema, in quanto avevamo intenzione di incorporare altri metodi analitici a valle in tandem con TFM, che può essere difficile con approcci TFM di fine punto distruttivi. In secondo luogo, l’utilizzo di un riferimento implicito basato su array grigliati consente un’automazione quasi completa dell’analisi dello spostamento. La regolarità delle matrici crea un flusso di lavoro prevedibile in cui la occorrenza di casi eccezionali (ad esempio, dati di cella di esempio contenenti artefatti imprevisti, ad esempio spaziatura dei marcatori non ottimali o mancata corrispondenza di registrazione) può essere mantenuta al minimo. In terzo luogo, l’ocquali dire la necessità di acquisire un’immagine di riferimento offre la libertà di monitorare molte celle su un singolo campione per lunghi periodi di tempo. Questo contrasta con gli approcci tradizionali basati sul tallone, dove, a seconda della fedeltà dei movimenti automatici dello stadio del microscopio, gli errori di posizionamento possono accumularsi e aumentare la difficoltà di registrare correttamente le immagini di riferimento alla tensione cellulare Immagini. Nel complesso, questa piattaforma facilita una maggiore velocità effettiva nella raccolta dei dati di tensione cellulare.

Con questo protocollo, speriamo di familiarizzare i lettori con la tecnica litografia a scansione laser a due fotoni che abbiamo implementato per generare questa piattaforma TFM senza riferimenti per misurare i componenti di trazione in piano e fuori piano generati dalle cellule semi-seme sulla superficie. Non trattata in questo protocollo è la sintesi di alcuni dei componenti monomerici. In generale, queste reazioni includono schemi di reazione di sintesi di sintesi quasi identici “one-pot” descritti in precedenza²¹, e alternative a questi prodotti possono anche essere acquistati. Il nostro obiettivo è anche quello di familiarizzare i lettori con gli strumenti basati su software che abbiamo generato per promuovere l’uso di microscopi a scansione laser disponibili in commercio come strumenti di stampa 3D e per facilitare l’analisi degli spostamenti dei marcatori fiduciari.

Protocol

1. Fotopolimerizzare un idrogel di base PEGDA Raccolta di reagenti Raccogliere fenilio di litio-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP), 3.4 kDa poli(ethylene) diacritaglio glicole (PEGDA), n-vi Pirrodonenyl (NVP), AlexaFluor 488 con etichetta PEGDA (PEG-488), AlexaFluor 633 con etichetta PEGDA (PEG-633) e peptide RGDS PEGylated ( PEG-RGDS) dai rispettivi congelatori e portare ciascuno a temperatura ambiente. Nei tubi separati di microcentrismo d’ambra, misurare 3 mg di LA…

Representative Results

Nel corso del protocollo, vi sono una serie di punti di controllo che forniscono feedback per valutare la qualità della procedura di modellazione. Per fornire alcune informazioni su come valutare i progressi in ciascuno di questi punti di controllo, forniamo risultati rappresentativi di un esperimento vero e proprio. I risultati evidenziano l’applicazione di questo protocollo eseguito su un idrogel fotofatto preparato per l’analisi TFM delle cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC). I risultati includono …

Discussion

L’obiettivo di questo protocollo è quello di fornire un flusso di lavoro che allevia gran parte della difficoltà associata alla generazione e all’analisi dei dati TFM. Una volta preparati, gli idrogel fotodorali sono semplici da usare, richiedendo solo la conoscenza delle pratiche standard di coltura dei tessuti e la microscopia a fluorescenza. L’aspetto senza riferimenti consente una navigazione spensierata sugli idrogel carichi di cellule ed elimina passaggi di elaborazione delle immagini ingombranti come la registra…

Materials

Acrodisc Syringe Filter, 0.2 μm Supor Membrane, Low Protein Binding	Pall	PN 4602	Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.
Acrylate-Silane Functionalized #1.5 Coverslips	in-house	in-house	Acrylates allow binding of base hydrogel to the glass surface to immobilize the hydrogels. See reference: 21-24
Axio-Observer Z1 w/Apotome	Zeiss		Widefield microscope with structured illumination module used to capture images for TFM.
Chameleon Vision ii	Coherent Inc.		Equipped on laser-scanning microscope used for multiphoton Lithography.
Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil	3M		Binds acrylate-silane functionalized coverslips to Petri dishes.
Flexmark90 PFW Liner	FLEXcon	FLX000620	Allows lining of double coated tape enabling feeding of tape into plotter.
LSM-880	Zeiss		Laser-Scanning microscope used for Multiphoton Lithography.
MATLAB	Mathworks	R2018a	Runs custom scripts to generate lithography instructions for microscope and for analysis of TFM data.
Model SC Plotter	USCutter	SC631E	Cuts double coated tape into rings to bind coverslips to petri dishes.
Objective C-Apochromat 40x/1.20 W Corr M27	Zeiss		Equipped on both widefield microscope and laser-scanning microscope to be used for both lithography and TFM.
PEG-AF633	in-house	in-house	Fluorophore-labeled acrylate PEG variant for creating fiducial markers. See reference: 21
PEG-DA	in-house	in-house	Base material for hydrogels. See reference: 21
PEG-RGDS	in-house	in-house	RGDS peptide-labeled mono-acrylate PEG variant for promoting cell-adhesion. See reference: 21
Petri Dishes	CELLTREAT	229638	8mm holes are cut into the center of each dish using a coring bit to fit base hydrogels.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	3097358-1004	For creating spacers to control base hydrogel thickness (aka PDMS).
Syringe, Leur-Lok, 1 mL	BD	309628	Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.
UV Lamp	UVP	Blak-Ray® B-100AP	Polymerizes base hydrogel.
1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP)	Sigma-Aldrich	V3409-5G	Radical accelerant and co-monomer. Improves pegylated fluorophore incorporation during lithography.