Измерение фагоцитоза Aspergillus fumigatus Conidia человеческими лейкоцитами с помощью цитометрии потока
Summary
Этот протокол обеспечивает быстрый и надежный метод количественного измерения фагоцитоза Aspergillus fumigatus conidia человеческими первичными фагоцитами с использованием цитометрии потока и дискриминировать фагоцитоз конидии от простого прилипения к лейкоцитам.
Abstract
Инвазивная легочная инфекция плесенью Aspergillus fumigatus представляет большую угрозу для пациентов с ослабленным иммунитетом. Вдыхаемые грибковые конидии (споры) очищаются от альвеолов легких человека путем фагоцита врожденными моноцитами и/или нейтрофилов. Этот протокол предлагает быстрое и надежное измерение фагоцитоза цитометрией потока с использованием флуоресцеина изотиоцианата (FITC) с маркировкой кониии для совместной инкубации с человеческими лейкоцитами и последующего противопоразрезания с анти-FITC антитела, чтобы позволить дискриминации интернализированной и клеточной приверженности conidia. Основными преимуществами этого протокола являются его быстрота, возможность совмещения анализа с цитометрическим анализом других клеточных маркеров, представляющих интерес, одновременный анализ моноцитов и нейтрофилов из одного образца и его применимость к другим клеточным настенным грибам или бактериям. Определение процентных долей фагоцитов лейкоцитов предоставляет микробиологам средства для оценки вирулентности патогена или для сравнения патогенных диких типов и мутантов, а также иммунологов для исследования возможностей лейкоцитов человека по борьбе с патогенными микроорганизмами.
Introduction
Инвазивный аспергиллез легких представляет большую угрозу для пациентов с ослабленным иммунитетом, так как варианты лечения ограничены и успешны только при ранней диагностике, что приводит к высокой смертности1. Инфекционные агенты conidia (споры) формы Aspergillus fumigatus, которые повсеместно в большинстве мест обитания2. Conidia вдыхаются, проходят через дыхательные пути и может, наконец, войти в легких альвеолы. У иммунокомпетентных людей, эти конидии очищаются врожденными иммунными клетками, такими как моноциты или макрофаги и нейтрофильные гранулоциты, которые занимают (фагоциты) и переваривают патогены3. Фагоцитоз имеет важное значение для микробиологов и иммунологов также, когда заинтересованы в принимающей патогенвзаимодействия взаимодействия. Конфронтационные анализы, такие как совместное инкубацию лейкоцитов и конидии, часто включают маркировку спор флуоресценгом или его производным флуоресцеем изотиоциана (FITC). Используя микроскоп, это просто определить интернализированные флуоресцентные конидии и определить прилагается / приверженец conidia, хотя этот подход является громоздким и реально ограничивается несколько сотен клеток4. Однако, в потоке цитометрии, которая легко позволяет анализ сотен тысяч клеток в течение нескольких минут, дифференциальное окрашивание фагоцитозных и приверженцев conidia имеет жизненно важное значение. Таким образом, многие протоколы полагаются на Trypan Blue, чтобы утолить FITC-флуоресценцию от адепта conidia5,6,7,8. Другой подход является использование флуоресценции резонанса передачи энергии бромида этидия и FITC излучать красный вместо зеленого флуоресценции от приверженца conidia9,10,11. Если конкретные антитела доступны, как и в случае с некоторыми бактериями, клеточные частицы могут быть непосредственно окрашенных12,13.
Здесь мы представляем протокол для быстрой и количественной оценки фагоцитоза FITC-маркировки A. fumigatus conidia человеческими лейкоцитами наряду с прикреплением спор к клеткам и отсутствием взаимодействия, используя аллофикоцианин (APC)-связанные антитела FITC. Метод также позволяет одновременно цитометрический анализ потока дальнейших маркеров клеток, которые могут быть использованы для отдельного анализа фагоцитоза моноцитами и нейтрофиловизмом из того же образца.
Протокол может быть применен для характеристики грибковых штаммов (например, несколько видов Аспергилл и других форм из рода Mucorales представлены здесь) и их мутантов14 и иммунологических исследований на фагоциты, такие как лейкоциты от иммунокомпромиссных лиц.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол представляет собой метод быстрого потока цитометрического измерения взаимодействия A. fumigatus conidia с большим количеством первичных человеческих лейкоцитов, что невозможно в общих микроскопических протоколах. Воображение клеток с микроскопом и вручную подсчета интер?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим г-жу Пиа Стьера за отличную техническую помощь. М. фон Лилиенфельд-Тоал поддерживается Центром контроля и ухода за сепсисом (Федеральное министерство образования и здравоохранения Германии, BMBF, ФКЗ 01E01002) и исследовательским кампусом InfectoGnostics (BMBF, ФКЗ 13GW0096D). Тхи Нгок Май Хоанг поддерживается Школой микробной коммуникации Джены (Deutsche Forschungsgemeinschaft, ФКЗ 214/2)
Materials
| Adhesive foil | Brand | 701367 | |
| anti-CD14 V500 | BD Biosciences | 561391 | clone M5E2 |
| anti-CD45 BUV395 | BD Biosciences | 563792 | clone HI30 |
| anti-CD66b PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 562254 | clone G10F5 |
| anti-FITC APC | ThermoFisher Scientific | 17-7691-82 | clone NAWESLEE |
| Cell culture plate, 12-well | Greiner Bio-one | 665180 | |
| Cell scraper | Bioswisstech | 800020 | |
| Cell strainer, 30 µm | Miltenyi Biotech | 130-098-458 | SmartStrainer |
| Cytometer | BD Biosciences | LSR Fortessa II, lasers: 488 nm (blue), 405 nm (violet), 355 nm (UV) and 640 nm (red) | |
| Detergent | Sigma Aldrich | P1379 | Tween 20, 0.01% in PBS |
| Drigalski spatula | Carl Roth | PC59.1 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | ED3SS-500g | 2 mM in PBS |
| Erythrocyte lysis buffer | 0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA | ||
| Fetal Calf Serum (FCS) | Biochrom AG | S 0115 | 10% in RPMI 1640 |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC) | Sigma Aldrich | F3651-100MG | 0.1 mM in Na2CO3 /PBS solution |
| Formaldehyd | Carl Roth | PO87.3 | Histofix |
| Malt agar (1.5%) | malt extract (40 g), yeast extract (4 g), agar (15 g), Aqua dest. (1 L), adjust pH to 5.7-6.0, sterilise at 121 °C for 35 minutes | ||
| Na2CO3 | Carl Roth | 8563.1 | 0.1 M in PBS |
| Petri dish | Greiner Bio-one | 633180 | |
| Phosphat Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 189012-014 | without Calcium, without Magnesium |
| RPMI 1640 | ThermoFisher Scientific | 61870010 | RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement |
| Rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | MACSmix Tube Rotator |
| Round-bottom tube, 7.5 mL | Corning | REF 352008 | |
| Software for data acquisition and analysis | BD Biosciences | FACSDiva 8.0 | |
| V-bottom plate, 96 well | Brand | 781601 | untreated surface |
Riferimenti
- Brown, G. D., et al. Hidden killers: human fungal infections. Science Translational Medicine. 4 (165), 113 (2012).
- Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. Interaction of phagocytes with filamentous fungi. Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).
- Heinekamp, T., et al. Interference of Aspergillus fumigatus with the immune response. Seminars in Immunopathology. 37 (2), 141-152 (2015).
- Slesiona, S., et al. Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages. PLoS One. 7 (2), 31223 (2012).
- Busetto, S., Trevisan, E., Patriarca, P., Menegazzi, R. A single-step, sensitive flow cytofluorometric assay for the simultaneous assessment of membrane-bound and ingested Candida albicans in phagocytosing neutrophils. Cytometry A. 58 (2), 201-206 (2004).
- Lowe, D. M., et al. A novel assay of antimycobacterial activity and phagocytosis by human neutrophils. Tuberculosis (Edinb). 93 (2), 167-178 (2013).
- Nuutila, J., Lilius, E. M. Flow cytometric quantitative determination of ingestion by phagocytes needs the distinguishing of overlapping populations of binding and ingesting cells. Cytometry A. 65 (2), 93-102 (2005).
- Saresella, M., et al. A rapid evaluation of phagocytosis and killing of Candida albicans by CD13+ leukocytes. Journal of Immunological Methods. 210 (2), 227-234 (1997).
- Fattorossi, A., Nisini, R., Pizzolo, J. G., D’Amelio, R. New, simple flow cytometry technique to discriminate between internalized and membrane-bound particles in phagocytosis. Cytometry. 10 (3), 320-325 (1989).
- Heinzelmann, M., Gardner, S. A., Mercer-Jones, M., Roll, A. J., Polk, H. C. Quantification of phagocytosis in human neutrophils by flow cytometry. Microbiology and Immunology. 43 (6), 505-512 (1999).
- Perticarari, S., Presani, G., Mangiarotti, M. A., Banfi, E. Simultaneous flow cytometric method to measure phagocytosis and oxidative products by neutrophils. Cytometry. 12 (7), 687-693 (1991).
- Sveum, R. J., Chused, T. M., Frank, M. M., Brown, E. J. A quantitative fluorescent method for measurement of bacterial adherence and phagocytosis. Journal of Immunolological Methods. 90 (2), 257-264 (1986).
- de Boer, E. C., Bevers, R. F., Kurth, K. H., Schamhart, D. H. Double fluorescent flow cytometric assessment of bacterial internalization and binding by epithelial cells. Cytometry. 25 (4), 381-387 (1996).
- Hartung, S., et al. Fast and Quantitative Evaluation of Human Leukocyte Interaction with Aspergillus fumigatus Conidia by Flow Cytometry. Cytometry A. 95 (3), 332-338 (2019).
- Fei, C., Lillico, D. M. E., Hall, B., Rieger, A. M., Stafford, J. L. Connected component masking accurately identifies the ratio of phagocytosed and cell-bound particles in individual cells by imaging flow cytometry. Cytometry A. 91 (4), 372-381 (2017).
